형광성 Pseudomonas에서 Siderophore 생합성 유전자 탐색 = Molecular characterization of Siderophore Biosynthetic Gene in fluorescent Pseudomonads
Kanamycin-sensitive Pseudomonads을 Tn5를 이용한 돌연변이 유도를 실시하여 kanamycin에 내성을 갖는 transconjugants를 선별하였고, siderophore 생합성하지 못하는 돌연변이체를 선별하기 위하여 MKB 평판배지에서 황색 hallow를 형성하지 못하는 colony를 선별하였다. 선발된 돌연변이체들의 genomic DNA애 Tn5가 삽입되었음을 확인하기 위하여 Southen blot hybridiz-ation을 실시하여 intact Tn5에 homology를 나타내는 밴드를 확인하였다. 각각의 변이주에서 밴드의 위치가 서로 다르게 관찰됨으로써 Tn5가siderophore 생합성 유전자에 무작위적으로 삽입되었음을 알 수 있었다.
Gene library를 제조하기 위하여 wild typePY002의 genomic DNA를 Sau3A Ⅰ로 부분 절단하여 15-30kb 절편을 cosmid pLAFRS3에 접합하여 in vitro packaging 한 후 E. coli HB101얘 형질도입하여 P. fluorescens PY002의 genomic library를 재조하였으며, 이 library의 평균삽입 DNA 크기는 21kb였다.
Pseudomonas fluorescens PY002, isolated from soil, was mutagenized with a transposon Tn5. The transposon Tn5 was randomly transposed into the chromosomal DNA of P. fluorescens PY002, as judged by Southem blot analysis with Dig-dUTP-labelled pSUP5011 (pBR325::Tn5) as probe. To construct a gene library from P. fluorescens PY002, the Sau3AI partial digested chromosomal DNA fragments of 15-30kb in sizes were ligated with BamHI-restricted cosmid vector pLAFR3. After the in vitro packaging, the resulting phages were transfected into E. coli HB101 and plated onto LBagar plate containing tetracyclin (12.5 ㎍/ml). The average sizes of insert DNA contained in the constructed gene library were approximately 21 kb in size range and the transduction number per 1 ㎍ of insert DNA was 9 x 10^3.
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