PRDM10 HMTase subcloning 및 결합단백질 동정
저자
발행사항
춘천 : 강원대학교 대학원, 2010
학위논문사항
학위논문(석사)-- 강원대학교 대학원 일반대학원 : 생물학과 2010. 2
발행연도
2010
작성언어
한국어
주제어
KDC
476.10733 판사항(5)
발행국(도시)
강원특별자치도
기타서명
Subcloning and Identification of Binding Protein of PRDM10 HMTase
형태사항
54 p. 26cm
일반주기명
참고문헌: p. 46-50
소장기관
Chromatin의 구조적 변화는 histone의 acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitination등 다양한 modification에 의해 조절 되어 지며, 그 중 histone methylation은 PR/SET-domain을 포함하는 단백질군에 의해서 조절 되는 것으로 알려져 왔다. PRDM10은 N-terminal 부위에 PR-domain을, C-terminal 부위에 zinc finger motif를 포함하는 단백질로 HMTase activity가 있을 것으로 추정되는 단백질이다. 그러나 다른 PRDM 단백질군에 대한 연구가 활발히 진행된 것에 반해, PRDM10의 연구는 거의 이루어지지 않아 기능에 대한 보고가 없는 실정이다. Chromatin remodeling factor로서의 PRDM10의 기능을 알아 보고자 HMTase assay를 수행하였으며, 그 결과 histone H3를 target으로 하는 HMTase activity가 있음이 확인되었다. 또한 immunostaining을 통해 세포 분열기에 H3K9 trimethylation과 PRDM10이 동반적하여 증가함이 확인됨에 따라 chromatin의 구조적 변화에 H3K9의 trimethylation과 PRDM10이 관여 할 것으로 추측 된다. 그 외의 PRDM10 기능 조사를 위해 full-length sequence에서 PR-domain을 포함하는 N과 비교를 위한 중간부위의 M, C-terminal 부위의 C를 선정하여 subcloning을 통해 재조합 단백질을 확보 하였다. PRDM10과 결합하는 단백질을 동정하기 위해 재조합 PRDM10을 과발현 시킨 후 핵 단백질과 혼합 하여 MALDI-TOF/MS 및 bioinformatics를 통해 Ku70/80과 결합하고 있음을 확인하였다. PRDM10과 Ku70/80이 결합하고 있음은 immunoprecipitation과 GST pull-down을 통한 실험에서도 확인 할 수 있었으며, 흥미롭게도 세포내에서 PRDM10이 과발현 되었을 경우 Ku70/80의 발현수준이 낮아지는 것을 확인하였다. 이와 같은 실험 결과는 PRDM10의 정확한 기능을 밝히는 연구에 유용한 정보를 제공 할 것으로 사료된다.
더보기PRDM10 contains PR-domain that is presumed as HMTase family, and C2H2-type zinc-fingers that is a DNA binding motif. This study show that PRDM10 has an HMTase activity toward H3K9 trimethylation by performing in vitro methylation assay using histones substrates and S-adenosyl-[methyl-14C]-L-methionine as methyl donor. Furthermore, to identify function of PRDM10, these were subcloned N, M or C of PRDM10 protein into pGEX-4T1 prokaryotic expression vector, respectively. A screening was tried to identify PRDM10-interacting proteins, using the subcloned fragments as a bait. We found that Ku70/80 proteins interact with C-terminal region of PRDM10 using MALDI/TOF and bioinformatics. Ku70/80 heterodimer have been implicated in multiple nuclear processes, such as DNA-damage repair, telomere maintenance and apoptosis. We also confirmed that PRDM10 is directly binding with Ku70/Ku80, both immunoprecipitation and GST pull-down. Moreover, expression over of PRDM10 suppressed Ku70/Ku80 expression levels. Therefore, this study suggest that PRDM10 might interact with Ku70/80 and regulate its expression for regulation of damaged DNA repair.
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