콜레스테롤 저하 유산균의 특성 및 형질전환 = Characteristics and transformation of cholesterol-lowering lactic acid bacteria
저자
발행사항
[광주]: 전남대학교, 1999
학위논문사항
학위논문(박사)-- 全南大學校 大學院: 農化學科 1999
발행연도
1999
작성언어
한국어
주제어
KDC
521.3
발행국(도시)
대한민국
형태사항
vi, 127 p.
소장기관
국외 전통 발효유와 국내 김치 및 젖갈류로부터 우유 응고력이 우수하며, 내산성 균주인 66주를 분리한 후 in vitro에서 콜레스테롤 저하 정도가 30%이상인 균주 4주를 선발하였고, 이 중 2주를 선발균주로 하였다. 이들 선발균주는 각각 Lactobacillus casei 그리고 L. rhamnosus로 동정되었으며, 이들을 L. casei 0781, L. rhamnosus로 명명하였다. 선발균주의 최적 성장 배지 및 배양 온도는 MRS및 37℃이었으며, pH 2.0에서 L. casei 0781균주가 더 강한 내산성을 보였고, pH3.0에서는 내산성 비율이 두 균주 모두 유사하였다. 또한, 선발균주의 in vitro에서의 콜레스테롤 저하 정도는 L. rhamnosus 2084 균주가 약 55.6%로 가장 우수하였고, L. casei 0781은 약 48.9%이었다 이 두 선발균주는 L. acidoplulus 145의 48.8% 보다 높은 콜레스테롤 저하 정도를 나타내었다. 선발균주의 콜레스테롤 저하 기능을 초음파 파쇄에 의한 세포 저항성, TLC 그리고 GC등으로 조사한 결과, 선발균주에 의한 콜레스테롤의 대사는 관찰할 수 없었으며, 단지 세포막내로 침착 또는 흡수되어 세포막 성분 변화의 원인으로 작용하는 것으로 판단된다.
S. aureus, P. aeruginosa와 E. coli 그리고 B. subtilis에 대하여 우수한 항균성을 갖는 선발균주를 oxgal이 각각 0.1, 0.3, 0.5% 첨가된 0.005M 인산나트륨 완충용액 (pH7.0)으로 37℃에서 1.5시간 간격으로 처리하였을 때 1.5 시간 이후 선발균주 중 L. rhamnosus 2084가 내담즙성이 가장 우수하였다. 또한, pH, 배양 시간, 배양 온도, 완충능 그리고 생균수 등을 고려했을 때, 선발균주에 의한 발효유 제조의 최적 배양 온도는 L. rhamnosus 2084와 L. casei 0781 모두 40℃이었고, 최적 배양 시간은 각각 4시간, 6시간이었다. 대조균주인 L. acidophilus 145는 40℃에서 8시간이었다. 일반적으로, L. casei 0781은 Bios 2000에 대하여, L. rhamnosus 2084는 yeast extract에 그리고 L. acidophilus 145는 yeast extract와 Bios 2000에 대하여 가장 높은 산 생성 효과가 있었으며, 이때 acetic acid와 lactic acid의 함량이 가장 많았고, citric acid는 가장 낮은 함량을 나타내었다.
요구르트 제조는 원유를 81%로 하고 각종 당과 청포도 농축액, 그리고 혈당 및 콜레스테롤 저하 기능이 있다고 알려진 silk powder를 첨가하였고, Brix 16%의 당도가 되도록 하였다. 제조 발효유의 관능검사는 panel 20명을 선정하고 2점 기호선택시험을 사용하여 t-검정으로 유의성을 조사한 결과 L. rhamnosus 2084로 제조한 발효유의 관능평가가 가장 좋은 것으로 나타났다. 발효유를 급여하지 않은 군을 대조군으로 하고 급여한 군을 실험군으로 하여 2주 간격으로 rabbit의 혈액을 채취한 후 total cholesterol, LDL, HDL의 함량을 측정한 결과, 6주 후부터 대조군과 실험군 사이에 콜레스테롤 저하효과가 관찰되었다. 이들 토끼의 대동맥의 병리 조직학적 검사 결과, 발효유를 급여하지 않은 군에서는 대동맥에서 동맥경화증의 소견이 뚜렷이 관찰되었으며, 발효유를 급여한 군에서는 이러한 병변의 소견이 경미하거나 전혀 관찰되지 않았다. 특히 L. rhamnosus 2084로 제조한 발효유를 급여한 군의 경우, 병변이 가장 적었다.
선발균주의 원형질체 형성은 500□/□의 lysozyme과 25□/□의 mutanolysin을 동시에 첨가하여 37℃에서 60분간 처리하였을 때 99.96% 이상의 원형질체 형성율을 나타내었고, 최종농도 0.1%의 glucose가 첨가된 배지에서 선발균주를 배양하였을때 0.5% glucose에서 보다 높은 재생 빈도를 보였으며, L. casei 0781, L. rhamnosus 2084 그리고 Streptococcus(S.) thermophilus 2590은 LCM-R 재생 배지에서, 그리고, S. thermophilus 13101은 TCM-R 재생배지에서 가장 높은 재생 빈도를 보였다. 또한, PEG를 대개로 각 균주의 항생제 내성을 선발 marker로 이용하여 22 개체의 융합 균주를 선발한 후 융합체의 안정성을 조사하였으나, 4-10회의 계대 배양 동안 대부분이 segregation 되었다.
한편, L. casei 0781과 L. rhamnosus 2084에 pKH80 plasmic DNA를 electrotransformation한 결과, 두 균주 모두 4.5kV/cm의 field strength에서 가장 높은 형질 전환의 효율을 보였으며, L. casei 0781보다 L. rhamnosus 2084의 pulse 후 균주 생존율이 높았다. 또한, field strength와 parallel resistor에 따른 time constant가 증가할수록 균주 생존율과 형질전환율은 감소하였다. 따라서 field strength가 4.5kV/cm이며, time constant가 4.7ms 일때 가장 높은 형질 전환 효율을 나타내었다. Electroporation buffer의 경우, cold-deionized water를 buffer로 사용하였을 때, L. casei 0781, L. rhamnosus 2084 두 균주 모두에서 가장 높은 형질 전환 효율을 보였고 이때의 time constant는 4.5ms 이었다.
The sixty six strains of lactic acid bacteria which had milk clotting ability and acid-tolerance were separated from foreign fermented milk, Kimchi and pickled fish products. Among them, four strains had an effect of lowering cholesterol by over 30% and two strains of them were used as experimental strains. So, they were identified as Lactobacillus (L.) casei, and L. rhamnosus, and noted as L. casei 0781, and L. rhamnosus 2084, respectively.
The optimum growth media and temperature of the selected bacteria were MRS medium and 37℃. L. casei 0781 was more tolerant against acid in its media adjusted to pH 2.0, but not significantly different in the tolerance against acid at pH 3.0. And, the tolerance of the selected bacteria against acid was higher than that of L. acidophilus 145. Among the two selected strains, L. rhamnosus 2084 had the best ability of lowering cholesterol level, the value of that was about 55.6%, and L. casei 0781 was about 48.9%. Therefore, ability of lowering cholesterol level of those two strains was higher than about 48.8% of L. acidophilus 145. It was considered that the effect of lowering cholesterol level by the selected lactic acid bacteria was not caused by metabolism but the adsorption on cell membranes of the bacteria as a result of analysis by ultra sonication, TLC, and GC.
Also, when the inhibitory selected lactic acid bacteria against S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, and B. subtilis were treated with 0.005M sodium phosphate containing 0.1%, 0.3%, and 0.5% oxgal at 37℃ for 1.5 hours intervals, L. rhamnosus 2084 was the most tolerant against bile acid. And, optimum temperature for manufacture of yogurt by L. casei 0781 and L. rhamnosus 2084 were 40℃, and incubation time were 6 hours and 4 hours, respectively. These conclusions related with incubation time, pH, acidity value, and lactic acid bacterial counts. L. acidophilus 145 as a control was incubated for 8 hours at 40℃. Generally, the acid production of L. casei 0781 for Bios 2000, L. rhamnosus 2084 for yeast extract, and L. acidophilus 145 for yeast extract and Bios 2000 as growth promoting materials was the most enhanced than for others. This time, acetic acid and lactic acid existed by the most amount in yogurt base.
For preparation of fermented milk, the mixture of raw materials was 81% of milk fortified with various sugar and concentrations of grapes. Additionally, silk powder known as a cholesterol-lowering substance was fortified and Brix was adjusted to 16%. And, sensory evaluation of fermented milk was performed by 20 members of trained panel, Students't test being used for sensory evaluation analysis. The results showed that fermented milk treated with L. rhamnosus 2084 was more preferable in category for flavor and odor.
Also, total cholesterol, LDL, and HDL in rabbits fed with fermented milk showed an effect on lowering the levels of cholesterol in rabbit comparing with the control after 6 weeks. Additionally, severity of atherosclerosis was decrease in rabbits fed fermented milk, which was confirmed by pathological analysis of their aorta wall. When rabbits fed with fermented milk made with L. rhamnosus 2084, it was the most effective for decrease of atherosclerosis severity.
When the selected lactic acid bacteria were treated with 500ug/ml lysozyme and 25ug/ml mutanolysin for the protoplast formation for 60 min at 37℃, the protoplast forming yield was 99.96%. And, the regeneration yield of protoplast of the selected lactic acid bacteria grown in growth media containing 0.1% glucose were higher than that of 0.5% glucose. The regeneration frequency of L. casei 0781, L. rhamnosus 2084 and S. thermophilus 2590 was the highest on LCM-R regeneration medium, and that of S. thermophilus 13101 on TCM-R.
Futhermore, twenty two fusants were selected after induction of protoplast fusion mediated by PEG and use of selection marker by antibiotics. Stability of these fusant rapidly decreased during the successive cultivation from 4 to 10 times on selection medium.
Also, the optimum condition of electrotransformation that pKH80 plasmid DNA transfer to L. casei 0781 and L. rhamnosus 2084 was 4.5kV/cm of field strength and 4.7ms of time constant. The viability yield of L. rhamnosus 2084 was higher than that of L. casei 0781 after pulse, which was lower viability and transformation yield at higher field strength and time constant. The optimum electrotransformation buffer of both L. casei 0781 and L. rhamnosus 2084 was cold-deionized buffer, and the optimum time constant was 4.5ms.
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