Effects of Bisphenol A on Skeletal Muscles from ICR Mouse : Bisphenol A가 웅성 ICR 마우스의 골격근에 미치는 영향 연구
저자
발행사항
서울 : 서울여자대학교 대학원, 2003
학위논문사항
Thesis(M.A.)-- 서울여자대학교 대학원: 생물학과 2003. 2
발행연도
2003
작성언어
영어
주제어
KDC
472.193 판사항(4)
DDC
572 판사항(19)
형태사항
iii, 47p. : Illustrations ; 26cm .
일반주기명
Bibliography: p. 39-44
소장기관
Bisphenol A (BPA)는 에스트로겐의 활성을 가지는 내분비계 교란물질로서 주로 polycarbonate 플라스틱이나 epoxy resin의 주요 단량체이며 음식 용기의 보호막 및 치과 봉합제 등으로 사용된다. 이러한 BPA는 인간과 야생 생물의 건강을 위협하며 특히 생식기관에 악영향을 끼치는 것으로 알려져 있다. 그러나 현재 생식기관을 제외한 다른 기관에 미치는 환경호르몬의 영향에 관해서는 아직 많이 연구되어 있지 않다. 특히 BPA가 동물의 생식계와 내분비계를 제외한 다른 기관이나 운동 능력에 미치는 영향에 대해서는 거의 알려지지 않고 있는 실정이다.
따라서 본 실험에서는 BPA가 골격근에 미치는 영향을 연구하기 위하여 웅성 ICR 마우스를 사용하여 실험하였다. 마우스에 BPA를 농도 별 (0, 0.015, 1.5, 30 mg/ml)로 노출시킨 후 골격근의 형태적인 변화와 관련 효소 활성 변화는 물론, Ca^(2+) 대사와 관련 있는 SERCA1과 CaMK-IV의 전사에 미치는 영향을 in vivo에서 연구하였다. 먼저 BPA를 위에 나온 농도로 4주간 각각의 마우스 그룹에 경구 투여한 후, 마우스의 전체 몸무게와 여러 장기 무게의 변화를 관찰하였다. 비록 마우스의 무게에는 변화가 없었으나, 근육 이상의 표지가 되는 creatine kinase (CK)의 혈장 내 농도 상승을 측정하여 골격근이 손상되었음을 일차적으로 확인하였다. BPA 투여로 인해 골격근에 손상된 기전을 연구하기 위하여 전자현미경 사진을 찍어 골격근섬유의 형태적인 변화를 관찰한 결과, 근섬유 사이에 존재하는 소포체 (sarcroplasmic reticulum; SR)와 미토콘드리아에 팽윤 현상이 나타났고, 투여 농도에 의존적으로 미토콘드리아의 수적 증가가 관찰되었다. 이 결과를 생화학적으로 확인하기 위해 각각의 대표적인 marker enzyme인 근소포체의 Ca^(2+)-ATPase, 미토콘드리아의 Mg^(2+)-ATPase, SDH의 효소 활성도를 측정하였다. 전자현미경 사진의 결과와 일치하게 Ca^(2+)-ATPase의 활성은 농도에 따라 감소하는 반면, 미토콘드리아는 그 수의 증가로 인해 Mg^(2+)-ATPase의 활성이 증가하였고, SDH의 활성도 증가하는 경향을 보였다. 또한 근소포체의 Ca^(2+)-ATPase의 활성 감소와 미토콘드리아의 Mg^(2+(-ATPase 활성 증가 및 수적 증가가 관련 유전자의 전사 수준에서의 변화로 인해 초래 되는지 알아보기 위하여 Ca^(2+)-ATPase와 관련 있는 SERCA1과 미토콘드리아 생합성과 관련 있는 것으로 알려져 있는 CaMK-IV의 발현 정도를 측정하였다. SERCA1은 전사량에 변화가 없는 것으로 보아 효소자체가 아니라 활성조절에 관여하는 phosphorylation 등에 이상이 있음을 알 수 있으며, CaMK-IV는 BPA 농도에 따라 전사량이 증가한 것을 확인함으로써, BPA가 미토콘드리아의 biogenesis를 유발시켰음을 확인하였다.
이러한 결과들을 종합해 보면, BPA는 근소포체의 Ca^(2+)-ATPase에 활성조절이 정상적으로 이루어 지지 않아 Ca^(2+)의 유출과 유입의 불균형으로 인해 근소포체 구조의 팽윤 현상을 유발시켜 골격근내의 세포내 Ca^(2+)의 농도를 증가시킨다. 이미 보고된 바에 따르면 증가된 세포내 Ca^(2+)은 CaMK-4를 활성화 시키고 미토콘드리아의 biogenesis의 조절에 관여하는 PGC-1을 증가시켜 미토콘드리아의 수를 증가시킨다고 한다. 따라서 BPA에 의한 골격근 세포 내의 Ca^(2+)의 불균형으로 인해 미토콘드리아의 생합성을 유발시킨 것으로 추정된다.
In vitro 실험을 통해 BPA가 skeletal myoblast에 미치는 영향에 대해서 알아보기 위해, L6 세포주 (murine skeletal myoblast)에 BPA를 농도(0, 10, 75, 100μM) 에 따라 처리한 후, MTT assay와 trypan blue assay를 통해 cell viability를 측정하였다. Trypan blue assay 결과에서는 세포의 수가 농도 순으로 감소되는 것으로 나타났으나, 미토콘드리아의 SDH 활성을 viability의 측정기준으로 삼고 있는 MTT assay 결과에서 고농도인 100μM BPA를 처리한 세포의 경우 오히려 효소 활성이 증가하는 것이 발견되었다. 이는 in vivo 실험에서의 SDH 활성과도 일치한다고 할 수 있다. 또한 BPA를 처리한 세포주로부터 DNA를 추출하여 세포 사멸 기전을 관찰한 결과 BPA가 apoptosis가 아닌 다른 기전을 통해 골격근의 손상을 일으킴을 알 수 있었다.
우리는 이와 같은 실험을 통해 내분비계 장애물질인 BPA가 마우스 골격근의 구조, 효소활성 변화 및 Ca^(2+) 불균형을 초래함으로써 손상을 일으킨다는 것을 보여주었다. 이러한 연구결과는 생식계에 관한 연구에만 국한되어 있던 내분비계 교란물질의 연구에서 벗어나 이러한 내분비계 교란물질이 골격근에도 손상을 미치는 것을 보여주었다는 것은 거의 연구되지 않았던 분야에 초석이 될 것이라고 생각된다. 또한 내분비계 교란물질의 골격근에 미치는 영향은 평활근 및 심장근에도 유해한 영향을 줄 수 있음을 제시했다는 점에서 매우 획기적이고 유용한 연구로 생각된다.
Bisphenol A [BPA, 2,2-bis (4-hydroxyphenyl) propane] is one of strong endocrine disruptors that have been known to exhibit weak estrogenic or anti-androgenic activity and thereby may represent a threat to health and reproductive efficiency in human and wildlife populations. However, the effects of BPA on other organs and systems have been poorly understood. Especially, the effects on muscular activity or organ weights of animals scarcely have been reported and studied.
Hence, the present study proposes to investigate BPA effects on mouse skeletal muscles. Histological, biochemical and molecular biological studies were performed. BPA was exposed to male ICR mice at the dose of 0.015, 1.5, or 30 mg/ml in drinking water. After 4-week BPA treatment, we compared experimental outcomes between control group and BPA treated groups, such as individual organ weights, total body weights, conformation of thin-sectioned muscle fibers, enzyme activities, gene expression, and etc. Individual organ weights and total body weights among groups were not significantly different, while creatine kinase (CK), a marker enzyme for muscular damage, was prominent in serum of BPA-treated mice. In addition, transmission electron microscopy (TEM) image revealed some morphological abnormalities in sarcoplasmic reticula (SR) and mitochondria; SR and mitochondria between myofibrils were swelled, and particularly the number of mitochondria was increased. Biochemically, we assayed enzyme activities, such as Ca^(2+)-ATPase activity in SR and both Mg^(2+)-ATPase and succinate dehydrogenase (SDH) activities in mitochondria. Ca^(2+)-ATPase activity in SR was decreased by BPA treatment, but there was no difference in transcriptional level of SERCA1, Ca^(2+)-ATPase in adult skeletal muscle. Mg^(2+)-ATPase activity in mitochondria was increased, and the transcription level of CaMK-IV, which participates in mitochondrial biogenesis, was increased as well. Even though differences were not significant, SDH activity tended to increase in BPA treated groups.
These results suggest that BPA may damage SR Ca^(2+)-ATPase, causing increased level of intracellular Ca^(2+). Then, Ca2+ overload can activate CaMK-IV to perform mitochondrial biogenesis. Although BPA may ruin mitochondria functioning, their Mg^(2+)-ATPase and SDH activities were increased because they increased in number. In short, BPA causes damages to skeletal muscles through morphological and biochemical alterations in SR and mitochondria in vivo (Ruehlmann et al., 1998).
To investigate the BPA effects on skeletal myoblasts in vitro, BPA was treated (0, 10, 75, 100 mM) in the L6 cell line (murine skeletal myoblast). After that, cell viability was measured with tryphan blue assay and MTT assay. According to tryphan blue assay, the cell count was decreased as BPA increased in dose-dependent manner. On the contrary, MTT assay, which presents cell viability by quantifying SDH from mitochondria (Maehara et al., 1988), showed that the cell viability was rather increased than decreased at highest concentration (100 mM) of BPA. Therefore, the result of MTT assay was consistent with the result of SDH assay in vivo. In addition, through analysis of DNA fragmentation, we could know that myoblasts were not killled through apoptosis mechanism by BPA. BPA may induce cell death not by apoptosis but by some other mechanism.
All in all, our experiments suggest that BPA has not only adverse effects on reproductive system as already known, but also has adverse effects on skeletal muscles of human and wild populations. According to results of in vivo and in vitro experiments, it was elucidated that BPA has adverse effects on adult skeletal muscles as well as myoblasts.
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