활성형 Vitamin D₃ 전환능을 소유한 방선균에서 P-450 Hydroxylase유전자의 클로닝 전략 = Cloning Strategies of the Genes for P-450 Type Vitamin D₃ Hydroxylase from Actinomycetes
비타민 D₃는 포유동물이나 새의 간에서 25-hydroxyvitamin D₃[25(OH)D₃]로 전환되는데, 이 hydroxylation은 P-450 hydroxylase에 의해 촉매된다고 알려져있다. 본 연구에서는 활성형 비타민 D₃전환능을 소유한 방선균에서P-450 hydroxylase효소를 신속하게 분리가능한 PCR방법을 보고하고자 한다. Primer는 방선균에서 보고된 P-450 hydroxylase들 사이의 아미노산 서열의비교를 통해 산소결합부위와 heme-ligand pocket 주의에서 제작되었고,5종의 방선균에서 효과적으로 PCR증폭산물을 획득할 수 있었다. 증폭산물을 획득할 수 있었다.증폭 산물들의 아미노산서열을 분석한 결과 기존에 밝혀진 많은P-450 hydroxylase유전자들과 상동성을 보이고 있었으며, 특히 Streptomyces griseolus에서 분리되어 sulfonylurea 등의 제초제의 분해능력을 가진 SuaC, SubC 효소 등과 높은 아미노산 상동성을 지니고 있었다. 이러한 PCR전략은 방선균에서 유용한 물질의 대사에 관여하는 P-450 hydroxylase효소의 클로닝에 도움을 줄 것이라 사료된다
더보기In mammals and birds, vitamin D₃is converted to 25-hydroxyvitamin D₃[25(OH)D₃] and then to 1α25-dihydroxyvitamin D₃[25(OH)₂D₃]in the liver and kideny, respectively these hydroxylating reactions are known to be catalyzed by P-450 hydroxylases. In this paper we report a PCR method which can be used for the repid amplification of DNA fragments for _450 hydroxylase from actinomycetes which can convert to active from of vitamin D₃. Primers were designed based on several regions sharing strong similarities in amino acid sequence of P-450 hydroxylases from a variety of actinomycetes, primarily in the regions of an oxygen binding site and a heme ligand pocket. These primers were used to amplify DNA fragments from five different actinomycetes. The deduced amino acid sequences of the isolated fragments revealed significant similarities to known P-450 hydroxylase including the product of the suaC or subC genes from Streptomyces griseolus that is capable of metabolizing a number of sulfonylurea herbicides and to the product of the P450sca2 from S. carbophilus that produces a specific HMG-CoA reductase inhibitor. This method will be helpful for the researchers in cloning the genes for P-450 hydroxylase involved in the biosynthesis of useful compounds.
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