Evaluation of Blood mRNA Biomarkers, CD44 and COPS2, for Discrimination of Active and Latent Tuberculosis, and Healthy Individual = 활동성 결핵과 잠복결핵감염, 건강인을 구분하기 위한 전혈 mRNA 바이오마커로써의 CD44와 COPS2의 임상적 유용성 평가
저자
발행사항
부산 : 부산가톨릭대학교 일반대학원, 2022
학위논문사항
학위논문(박사)-- 부산가톨릭대학교 일반대학원 : 임상병리학과 면역학, 분자진단학 2022. 2
발행연도
2022
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
부산
형태사항
111 ; 26 cm
일반주기명
지도교수: 김성현
UCI식별코드
I804:21037-200000599610
소장기관
결핵은 전 세계적으로 여전히 심각한 보건 문제를 야기하고 있으며, 전 세계 인구의 3분의 1이 잠복결핵감염인 것으로 보고되었다. 잠복결핵감염자의 약 10%가 생애 중 활동성 결핵으로 발전될 수 있다는 위험성을 지니고 있다. 따라서, 활동성 결핵과 잠복결핵감염을 신속·정확하게 진단하는 것이 매우 중요하다. 최근에는 활동성 결핵과 건강인을 구분하기 위해 코호트 수집 분석을 통한 전장유전체(Genome-wide association study, G-WAS) 분석이 시행되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 G-WAS 분석을 통해 유의성 있게 도출된 바이오마커와 전혈 검체를 이용한 mRNA sequencing 분석을 실시하여 그 결과를 비교 분석 함으로써, 활동성 결핵과 건강인을 구분 지을 수 있는 바이오마커를 도출하였다. 추가적으로 도출된 바이오마커가 활동성 결핵, 잠복결핵감염, 및 건강인을 구분할 수 있는지에 대한 임상적 유용성을 확인하기 위해 전혈 임상검체를 수집하여 평가하였다. 활동성 결핵 환자와 건강인의 전혈로부터 추출한 RNA를 이용해 mRNA sequencing 분석을 실시하여 총 24,424개의 유전자 발현을 확인하였다. 그 중 CD44와 ITGB2, PRNP, EMC4, COPS2, TNFSF8, NLRP3, PER1, KLF10, 그리고 IL10RA 유전자의 mRNA 발현이 건강인 군과 비교했을 때 활동성 결핵 환자군에서 더 유의성 있게 높은 발현을 나타내는 것을 확인하였으며, 통계학적으로도 유의함을 확인하였다(p < 0.05). 또한, ROC curve 분석을 진행한 결과 p 값이 0.05 미만이면서 area under curve (AUC) 값 또한 0.8 이상 나타내어 mRNA sequencing 분석을 통해 도출된 전혈 바이오마커가 임상적 유용성이 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 기반으로 하여, 도출된 전혈 바이오마커의 임상적 유용성을 확인하기 위해, qRT-PCR TaqMan probe 검사법을 고안하였으며, 고안된 검사법이 활동성 결핵, 잠복결핵감염, 건강인의 세 연구군을 구분할 수 있는지 평가해 보았다. 임상적 유용성 평가를 위해 총 152건의 전혈 검체를 수집하여 사용하였고, 이 중 40건은 활동성 결핵, 72건은 잠복결핵감염, 40건은 건강인 이었다. 수집한 전혈 검체를 결핵균 특이 항원인 ESAT-6, CFP-10, TB7.7로 자극하였을 때, CD44와 COPS2 유전자의 mRNA 발현양이 활동성 결핵 환자군에서 잠복결핵감염 또는 건강인 군에비해 유의하게 높게 발현하는 것을 확인하였고, 통계학적으로도 유의성이 있음을 확인하였다(p < 0.001). 반면에, ITGB2, TNFSF8, NLRP3, PER1, KLF10, 그리고 IL10RA 유전자 mRNA의 발현 정도는 활동성 결핵 환자군과 건강인 보다 잠복결핵감염 군에서 높게 발현되는 것을 확인하였고, 특히 ITGB2 유전자의 발현 수준이 통계학적으로도 유의함을 확인하였다(p < 0.05). 활동성 결핵과 건강인의 결핵균 특이 항원으로 자극한 전혈 검체에서 ROC 커브를 분석한 결과, CD44, ITGB2, COPS2, TNFSF8, PER1, 그리고 IL10RA 유전자 발현에 대한 p 값이 0.05 미만이었으며, AUC 값이 0.8 이상임을 확인하였다. 추가적으로, 도출된 바이오마커가 결핵균 특이 항원으로 자극하지 않은 전혈 검체에서 기본적으로 발현되는 양상을 확인하였다. 그 결과, CD44, ITGB2, PRNP, EMC4, COPS2, NLRP3, 그리고 KLF10 유전자의 mRNA 발현양이 활동성 결핵과 잠복결핵감염, 건강인 세 연구군을 구분할 수 있음을 확인하였으며, 통계학적으로도 유의함을 확인하였다(p < 0.05). 활동성 결핵과 건강인의 전혈 검체에서 ROC 커브를 분석한 결과, CD44, ITGB2, PRNP, EMC4, COPS2, PER1, 그리고 KLF10 유전자 발현에 대한 p 값이 0.05 미만이었으며, 특히 CD44, ITGB2, EMC4, COPS2, 그리고 KLF10의 p 값은 0.001 미만으로 매우 유의성이 있음을 확인하였다. 이 5가지 바이오마커에 대한 AUC 값은 0.7 이상이었으며, CD44와 COPS2 유전자의 AUC 값은 0.9 이상으로 매우 높은 수준임을 확인하였다. 또한, 전혈에서의 기본적으로 발현되는 바이오마커 유전자의 발현양과 결핵균 특이 항원으로 자극된 유전자의 발현양 간 상관관계를 분석한 결과, 본 연구를 통해 도출된 바이오마커 모두 결핵균 특이 항원 자극 유무와 상관없이 건강인 군에 비해 활동성 결핵 환자군에서 증가함을 확인하였다. 결론적으로, 결핵균 감염이 의심될 경우, 전혈 내 CD44와 COPS2 유전자의 mRNA 발현 수준의 확인을 통해 활동성 결핵과 잠복결핵감염, 건강인 군을 효과적이고 빠르게 구분지을 수 있을 것으로 사료된다. 추가적으로 결핵균이 감염되었을 때 숙주에서 나타나는 CD44와 COPS2 유전자의 발현 차이에 따른 면역 방어 기전과 병태생리학적 연구가 필요할 것으로 사료된다.
더보기Tuberculosis (TB) is a serious health problem worldwide. In addition, one-third of the world’s population has latent TB infection (LTBI), and 5% to 10% of people with LTBI are at risk of developing active TB (ATB) in their lifetimes. Therefore, an accurate diagnosis of ATB and LTBI is important. Recently, studies have been conducted to identify biomarkers that show differences between ATB and healthy individuals (HIs) using a genome-wide association study (G-WAS) with cohort-collected data. Therefore, in the present study, mRNA sequencing analysis was conducted to derive optimal host biomarkers in whole blood samples from Mycobacterium tuberculosis (MTB) infected individuals and confirmed the clinically diagnostic usefulness of derived biomarkers with clinical specimens. Five ATB samples and five HI samples were analyzed using a Hiseq X10 device for mRNA sequencing analysis. As a result, a total of 24,424 gene mRNA expressions were confirmed, and among them, the CD44, ITGB2, PRNP, EMC4, COPS2, TNFSF8, NLRP3, PER1, KLF10, and IL10RA gene mRNA expression levels were significantly higher in the ATB group than in the HI group, and these gene expressions were statistically significant (p < 0.05). When analyzed, the receiver operating characteristic (ROC) curve and p values of these 10 genes were all under 0.05, and the area under the curve (AUC) values were over 0.8. Based on these results, to validate the clinical usefulness of these mRNA biomarkers, a quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) TaqMan probe assay was designed and conducted to discriminate between the ATB, LTBI, and HI groups. A total of 152 whole blood samples were used in the present study, including 40 ATB, 74 LTBI, and 40 HI samples. As a result, when MTB-specific antigens were stimulated, the CD44 and COPS2 gene mRNA expression levels were significantly higher in the ATB group than in the LTBI and HI groups, and they were statistically significant (p < 0.001). On the other hand, the ITGB2, TNFSF8, NLRP3, PER1, KLF10, and IL10RA mRNA gene expression levels were higher in the LTBI group than in the ATB and HI groups, especially the ITGB2 gene expression level was statistically significant (p < 0.05) in these samples. The ROC curve analysis data in the ATB and HI groups showed that the p values of the CD44, ITGB2, COPS2, TNFSF8, PER1, and IL10RA genes were all under 0.05, and the p values of the CD44 and COPS2 genes were under 0.001. The AUC values of these markers were all over 0.8. Next, when using whole blood samples, the CD44, ITGB2, PRNP, EMC4, COPS2, NLRP3, and KLF10 gene mRNA expression levels were significant for the discrimination of the ATB, LTBI, and HI groups. Also, they showed statistical significance (p < 0.05). ROC curve analysis was showed that the p values of the CD44, ITGB2, PRNP, EMC4, COPS2, PER1, and KLF10 genes were all under 0.05, and the p values of the CD44, ITGB2, EMC4, COPS2, and KLF10 genes were under 0.001. The AUC of these markers were all over 0.7, especially the CD44 and COPS2 genes were over 0.9. The correlation coefficient analysis results showed that the mRNA expression levels of all the markers were in direct proportion compared with the MTB-specific antigen-stimulated and basal-state whole blood cells. In conclusion, when MTB infection is suspected, whole blood mRNA expression levels of the CD44 and COPS2 genes could be effectively and accurately used for the discrimination of the ATB, LTBI, and HI groups. Further study is required on immune evasion mechanisms and the pathogenesis of MTB infection using the CD44 and COPS2 genes.
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