이종장기이식의 체외모델 개발을 위한 돼지생식선줄기세포의 형질전환, 세포용해 및 핵이식
저자
발행사항
서울: 단국대학교, 2005
학위논문사항
학위논문(석사)-- 단국대학교 대학원 의학과 생리학전공 2005
발행연도
2005
작성언어
영어
주제어
DDC
612 판사항(20)
발행국(도시)
서울
기타서명
Transgenesis, Cytolysis and Nuclear Transfer of Porcine Embryonic Germ Cells to Develop In Vitro Model of Xenotransplantation
형태사항
vii,34 장; 26cm.
일반주기명
소장기관
현재 이종장기이식에 대한 연구는 대부분 돼지에서 사람으로의 장기이식에 집중되어 있는데, 그 이유로는 돼지의 장기가 해부 및 생리학적 특성에 있어서 인간과 유사한 점, 임신 기간이 짧고 다산성이며 가격이 저렴한 점, 무균상태에서 돼지의 사육이 가능한 점 등을 들 수 있다. 그러나 돼지의 장기를 인간에게 이식하였을 때 가장 큰 난점으로 초급성 거부반응이 지적되고 있으며, 이는 돼지세포의 표면에 있는 항원인 gal epitope 을 인간 혈액중의 xenoreactive natural antibody (XNA) 가 인식하기 때문이다. Gal epitope 과 결합한 XNA 는 보체를 활성화 시키며, 이로 인하여 초급성거부반응이 일어나 이식한 장기가 급속히 사멸하게 된다. 이에 대한 해결책으로 GalT 유전자적중돼지 및 보체억제인자 형질전환돼지를 생산하는 방법이 제시되고 있다.
그러나 초급성 거부반응을 극복할 수 있는 형질전환돼지의 생산은 그 효율이 대단히 낮고 다수의 형질전환돼지를 번식, 유지하는 비용이 많이 소요되며 생산된 형질전환돼지가 실제 장기이식에 효과적으로 사용될 수 있을지 예측하기가 어려운 등의 단점이 있다. 따라서 본 연구에서는 미분화 줄기세포인 돼지생식선줄기세포를 이용하여 이종간 장기이식용 형질전환돼지의 효용성을 세포차원에서 미리 검증할 수 있는 적절한 체외모델의 개발을 시도하였다. 돼지생식선줄기세포에 이종장기이식 시 거부반응을 제어할 수 있는 인간 보체조절유전자인 hCD46 를 도입한 후 유전자가 도입된 형질전환 돼지생식선줄기세포를 인간 항체 및 보체와 반응시켜 세포용해를 유도하였다. 정상적인 돼지생식선 줄기세포에서는 급속한 용해가 일어나는 반면에 형질전환 돼지 생식선줄기세포는 세포용해에 저항성을 나타내며 계속하여 생존하는 것을 확인하였다. 거부반응이 억제된 형질전환 돼지 생식선줄기세포를 이용하여 핵이식을 실시하였을 때 배반포까지의 발달률은 17.3% 였으며, 이 배반포들 중 89.5% 에서 형질전환 유전자의 도입을 확인 할 수 있었다.
본 연구에서는 돼지생식선줄기세포에 hCD46 유전자를 도입하고 세포용해에 대한 저항성을 조사하여 세포차원에서 이종간 장기이식의 효용성을 미리 검증할 수 있는 적절한 체외모델을 수립하였다. 또한 면역거부반응을 일으키지 않는
hCD46 형질전환 생식선줄기세포를 이용하여 복제수정란을 생산하였다. 앞으로 본 연구에서 개발된 체외모델을 이용하여 이종장기이식의 효용성이 미리 검증된 형질전환 복제수정란을 생산하고 대리모에이식하는 과정을 통하여 보다 효율적으로 이종장기이식에 사용될 수 있는 형질전환 복제돼지의 생산이
가능할 것으로 생각된다.
Pigs are considered the most likely source of organs for xenotransplantation due to their anatomical and physiological similarities to humans. Production of transgenic pigs including addition of human complement-regulatory protein genes and deletion of alpha-1,3-galactosyl transferase gene may overcome hyperacute rejection (HAR), the first and currently the most critical immunological hurdle in the development of xenogeneic organs for human transplantation. However, even after resolving HAR in pig-to-human xenotransplantation, a series of other transgenic pigs may be required to alleviate subsequent acute and chronic rejection and incompatibility of porcine proteins to human counterparts. Besides the intensive labor, time and cost consuming, the usefulness of such pigs in transplantation to humans is unpredictable. For these reasons development of reliable in vitro procedure to pre-evaluate effectiveness of transgenic approach would be beneficial. This study was performed to establish an in vitro model of xenotransplantation using porcine embryonic germ (EG) cells, undifferentiated stem cells derived from culture of primordial germ cells. Porcine EG cells were maintained in feeder-free state in DMEM containing 15% (v/v) fetal bovine serum and 1,000 units/ml leukemia inhibitory factor. Human complement downregulator hCD46 (also known as MCP, membrane cofactor protein) gene under the regulation of cytomegalovirus promoter was introduced into porcine EG cells. Transfected cells were selected by antibiotic treatment and confirmed by PCR. To test the resistance of hCD46-transgenic EG cells to human xenoreactive natural antibody and complement, both transfected and non-transfected EG cells were cultured for 1.5 days in DMEM containing 15% (v/v) normal human serum. The treatment of human serum did not affect the survival of hCD46-transgenic EG cells, whereas with the same treatment approximately one half of non-transfected EG cells failed to survive (p<0.01). Transgenic EG cells presumably capable of alleviating HAR were used as nuclear donor for subsequent transfer of nucleus into enucleated porcine oocyte. Among 110 reconstituted oocytes, 19 (17.3%) oocytes were developed to the blastocyst stage. Analysis of individual nuclear transfer embryos by PCR indicated that 89.5% (17/19) of embryos contained transgene hCD46. The PCR-negative embryos might be due to an incomplete antibiotic selection of cells after transfection. Overall, the present study demonstrate the cell culture-based model of xenotransplantation predicting the usefulness of particular transgenic pigs. Further experiments on differentiation of transgenic EG cells into various cell types, cytolytic analysis of such cells to assess efficiency of xenotransplantation and subsequent production and transfer of transgenic clone embryos to recipients may provide a useful new procedure to accelerate xenotransplantation research.
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