Agrobacterium을 이용한 치커리의 형질 전환 = Agrobacterium-mediated Transformation of Cichorium intybus L.
본 실험은 치커리 'Radicchio'(Cichorium intybus L.)에서 Agrobacterium을 이용한 형질전환에 영향을 주는 요인들을 적정화하기 위하여 실시되었다. 치커리 'Radicchio'의 자엽절편체를 이용한 kanamycin과 cefotaxime 항생제 감응성 검정 결과 20 mg·L^(-1) 이상의 kanamycin 농도가 형질전환 신초의 선발에 적당하고 200 mg·L^(-1)의 cefotaxime 농도가 절편체 생장에 부정적인 영향을 주지 않으며 배지 내 Agrobacteria를 제거하기에 적절함을 나타내었다. Terpene cyclase 유전자가 재조합된 PILTAB 벡터를 갖는 Agrobacterium tumefaciens LBA4404와의 효과적인 공동배양 기간은 3일간으로 결정되었다. IAA 1.0 mg·L^(-1), BAP 1.0 mg·L^(-1), kanamycin 20 mg·L^(-1) 그리고 cefotaxime 200 mg·L^(-1)를 함유한 선발배지에서 형질전환 된 것으로 여겨지는 신초들이 생산되어 발근을 위해 kanamycin 40 mg·L^(-1)와 cefotaxime 200 mg·L^(-1)이 첨가된 1/2MS 발근배지에 옮겨져 87%의 발근율을 보였다. 발근된 형질전환체들을 대상으로 terpene cyclase 유전자특이 primer를 이용한 PCR 분석이 실시되어 재분화 치커리 내로 1.64 kb 크기의 terpene cyclase 유전자의 성공적인 도입을 확인하였다.
더보기This experiment was initiated to optimize factors affecting Agrobacterium-mediated transformation in Cichorium intybus L. cv. Radicchio. The results from the antibiotic sensitivity test for kanamycin and cefotaxime using cotyledon explants of chicory 'Radicchio' suggested that the concentration of kanamycin above 20 mg·L^(-1) might be an appropriate level to make a selection on transgenic shoots possible and 200 mg·L^(-1) of cefotaxime also could be a proper concentration to remove Agrobacteria from the media without any negative effect on explants. The efficient duration for co-cultivation of cotyledon explants with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 harboring the recombinant binary vector PILTAB carrying 1.64 kb terpene cyclase gene was decided as 3 days. Putative transgenic shoots were produced on the selection media containing 1.0 mg·L^(-1) IAA, 1.0 mg·L^(-1) BAP, 20 mg·L^(-1) kanamycin, and 200 mg·L^(-1) cefotaxime and transferred to 1/2MS media supplemented with 40 mg·L^(-1) kanamycin and 200 mg·L^(-1) cefotaxime for rooting. The rooting ratio was 63% and putative transgenic plants with roots were obtained. Results from PCR analysis with terpene cyclase gene specific primers confirmed a successful insertion of 1.64 kb terpene cyclase gene into the genomic DNA of the regenerated chicory.
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