protoplast-fusion에 依한 澱粉에서 Ethanol의 單段醱酵能 酵母 開發 : I. Characteristics of two yeast strains and conditions for the protoplast formation and reeneration as a preliminary step in interspecific protoplast-fusion I. Interspecific Protoplast-fusion 을 爲한 酵母菌林의 諸特性과 Protoplast 調製 및 Regeneration 條件 = Development of a new yeast fermenting starch to ethanil in single process by protoplast-fusion
저자
吳秉夏 (서울大學校 農科大學 食品工學科) ; 黃殷成 (서울大學校 農科大學 食品工學科) ; 李炯周 (서울大學校 農科大學 食品工學科) ; 李啓瑚 (서울大學校 農科大學 食品工學科) ; 朴官和 (서울大學校 農科大學 食品工學科) ; 張海東 (서울大學校 農科大學 食品工學科) ; 徐鉉昌 (서울大學校 農科大學 食品工學科)
발행기관
서울大學校農科大學 (College of Agriculture Seoul National University)
학술지명
권호사항
발행연도
1984
작성언어
Korean
KDC
520.5
자료형태
학술저널
수록면
1-16(16쪽)
제공처
소장기관
澱粉으로 부터의 alcohol 醱酵能을 增進시키기 爲하여 澱粉糖化性 菌株인 Saccharomyces diastaticus와 優秀한 alcohol 醱酵性 菌株인 Saccharomyces uvarum을 母菌株로 하여 이들간의 同屬異種間 原形質融合(interspecific protoplast fusion)을 通한 優秀한 澱粉醱酵 性 alcohol 生産性 菌株를 새로이 開發할 目的에서 다음과 같은 一漣의 實驗結果를 얻었다.
S. diastaticus의 醱酵液과 S. diastaticus+S. uvarum 混合醱酵液의 風味特性등을 確認하였다.
風味成分 抽出은 methylene chloride와 diethylether를 가지고 neutral flavor fraction과 acidic flavor fraction으로 나누었고 gas chromatography를 通하여 同定 및 定量하였다. Neutral flavor fraction의 경우 S. diastaticus+S. uvarum 混合醱酵液이 S. diastaticus 醱酵液보다, ester成分中에서는 ethyl acetate와 ethyl undecanoate가 더 많았고, alcohol 成分中에서는 n-propanol과 n-butanol이 더 많았다. Acidic flavor fraction의 경우 C??~C?? fatty acid가 同定 및 定量되었는데 S. diastaticus+S. uvarum 混合醱酵液이 S. diastaticus 醱酵液보다 lauric acid, caprylic acid, capric acid 含量이 두드러지게 많았다.
S. diastaticus의 glucoamylase 生産性, glucoamylase의 分離 精製, 酵素力價 그리고 酵素學的 特性에서 optimum pH는 5.0, optimum temperature는 55℃ 이었다.
S. diastaticus와 S. uvarum을 母菌株로 이들 간의 protoplast fusion을 위한 基礎的인 硏究로서 두 菌株의 諸特性과 protoplast調製의 最適條件을 決定하고 protoplast의 regeneration 條件의 確立을 도모하였다.두 菌의 生育曲線에서 모두 培養開始 7~8 時間만에 對數期 中期에 到達되었으므로 protoplast 調製는 이 時期의 細胞를 쓰기로 하였다. Generation time은 S. diastaticus가 1.04, S. uvarum이 1.38 時間이었다. 細胞의 크기는 S. diastaticus 44.10?㎛³, S. uvarum 99.67㎛³로 S. uvarum이 2倍나 컸다. DNA 含量은 細胞 當 S. diastaticus 44.3fg, S. uvarum 37.6fg이었다. 30% glucose 및 soluble starch에 대한 두 菌株의 ethanol 醱酵能은 glucose에 對하여 S. uvarum 11.4%, S. diastaticus 8.9% 이었고 soluble starch에 對하여는 S. diastaticus 만이 6.9%이었다.
두 菌株는 generation time, 細胞크기 및 DNA 含量 等으로 보아 diploid strain임을 알 수 있었고, 融合株 選拔을 위한 marker 로는 Sacch. uvarum의 melibiose 資化能의 차이를 利用할 수 있음을 밝혔다.
Protoplast의 調製에는 β-glucuronidase와 Zymoyase를 使用하였는데 두 酵素 反應最適條件은 β-glucuronidase는 pH 8.0에서 10% 濃度의 溶液으로, Zymolyase는 pH7.5에서 20㎛/ml의 濃度의 溶液으로 하여 모두 70分間 處理하는 것으로 決定하였으나 이 정도의 處理時間에서는 protoplast가 극히 不安定하게 되어 regeneration frequency가 떨어지는 것을 確認하였으며, 特히 Zymolyase 處理로 얻어진 protoplast의 regeneration率이 낮은 것은 Zymolyase中에 不純物로 微量 混在한 protease가 protoplast의 노출된 membrane-bound protein을 分解함으로써 protoplast를 破壞시키기 때문인 것으로 추측되었다.
融合實驗에 利用할 수 있을 정도의 regeneration frequency를 얻기 위해서는 Zymolyase를 45分間 處理하여 얻은 protoplast를 1.5%의 polyvinylpyrrolicone이 加해진 OYPD培地에서 重層法으로 展開하여 regeneration시키는 것이 좋은 것으로 판명되었다.
As preliminary steps of protoplast fusion between Saccharomyces diastaticus and S. uvarum to develop a fusant of higher ethanol production from starch, characteristics of the two presumptive parent strains, optimal conditions for protoplast preparation and conditions for highrer regeneration frequency were investigated. To determine flavor characteristics of the parent strains, neutral and acidic flavor fractions were extracted from liquids fermented by S. diastaticus and S. diastaticus + S. uvarum with methylene chloride and diethly ether. The liquid by the mixed culture produced more ethly acetate, ethyl undecanoate, n-propanol, n-butanol, lauric acid, caprylic acid and capric acid than that by S. diastaticus. Glucoamylase from S. diastaticus was purified and activity, productivity, and characteristics were determined. Optimum conditions for the enzyme were pH 5.0 and 55℃. The two strains reached logarithmic phase in 7-8h during growth and the generation time was 1.04 in S. diastaticus and 1.38 in S. uvarum. Cell size and DNA content per cell of S. diastaticus were 44.10㎛³and 44.3 fg, and for S. uvarum, 99.67㎛³and 37.6fg. Ethanol productivities of S. diastaticus were 8.9% from 30% glucose and 6.9% from 30% starch and 11.4% from glucose with S. uvarum. Through determination of generation time, cell size, and DNA content per cell, both strains appeared as diploids, and differences in assimilability of melibiose and soluble starch of the two strains were selected as markers to determine the fusant. The optimal condition for protoplast formation was treatment of both strains with 10%
ß-glucuronidase at pH 8.0 or 20㎍/ml Zymolyase at pH 7.5 for 70 min. While the regeneration frequencies were very low at 70min exposure to Zymolyase because of the instability of protoplasts, the yeasts treated for 45min were better for regeneration. The regeneration frequencies were also enhanced by 3-6 times when the regeration was carried out with 1.5% polyvinylpyrrolidone which stabilized protoplasts.
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