노랑다발동충하초(Cordyceps bassiana)의 교배형 및 인공배양에 관한 연구 = Study on Mating Type and Artificial Culture of Cordyceps bassiana
저자
발행사항
춘천 : 강원대학교 대학원, 2009
학위논문사항
학위논문(석사)-- 강원대학교 대학원 일반대학원 : 응용생물학과 2009. 2
발행연도
2009
작성언어
한국어
주제어
발행국(도시)
강원특별자치도
기타서명
Study on Mating Type and Artificial Culture of Cordyceps bassiana
형태사항
59 p.p. 26cm
일반주기명
강원대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
지도교수:성재모
참고문헌 : p.
소장기관
노랑다발동충하초(Cordyceps bassiana)는 자연에서 드물게 채집되며 인공자실체를 잘 형성하지 않는다. 이러한 특성은 노랑다발동충하초(C. bassiana)의 연구와 이용을 어렵게 만든다. 본 연구에서는 국내에서 채집된 노랑다발동충하초(C. bassiana)로부터 분리된 균주를 이용하여 교배형 분석 및 인공배양에 관한 실험을 하였고, 이를 통하여 균주의 지속적인 확보 및 인공재배의 기초자료로 이용하고자 하였다.
강원대학교 동충하초 은행 Entomopathogenic Fungal Culture Collection, Kangwon National University, Chuncheon, Korea(EFCC)에서 보존중인 노랑다발동충하초(C. bassiana) C-12511-6×9와 C-12511-8×9로부터 분리된 단포자 균주를 이용하여 mating 실험을 하였고, 이로부터 C-15736을 포함한 12개의 균주를 선발하여 mating 실험을 반복하였다. 총 132개의 단포자 균주를 이용하여 mating 실험을 실시한 결과, 전체 균주의 82%는 A, a 대립교배형 균주의 mating에 의하여 인공자실체를 형성하였다. 단독으로 인공자실체를 형성한 C-15736을 포함한 4개의 균주를 선발하여 단포자 분리 후 mating 실험을 실시한 결과 A, a type으로 구분되었고, A×a에 의하여 인공자실체를 형성하였다. 이것은 단포자 분리과정에서 다포자(multi ascospore)를 분리하였음을 의미한다. 위의 실험에서 노랑다발동충하초(C. bassiana)는 heterothallic 균의 특성을 보였으며 이를 다시 확인하고자 Shurestha(2003)의 방법에 근거하여, C-15736-2×6을 포함한 4개의 균주를 선발하여 자성과 웅성을 조사한 결과 한쪽 배지에서만 인공자실체를 형성하였으며 이때 먼저 접종된 단포자 균주는 자성배우자이며 나중에 접종된 단포자 균주는 웅성배우자로 볼 수 있다. 이로써 노랑다발동충하초(C. bassiana)는 heterothallic 균임을 증명하였다.
C-15739-6을 포함한 3개의 다포자 균주와 C-15736-2×6, C-15746-2×4 조합균주를 이용하여 계대배양에 따른 인공자실체의 활력을 조사한 결과, 공통적으로 1차 계대 배양에서 활력이 저조하였고, 다포자 균주보다 조합균주에서 활력이 오래 지속되었다. C-15741-6의 2차 계대균주를 이용하여 Petri-dish상의 균사배양기간에 따른 인공자실체의 활력을 조사한 결과, 균사생장은 시간당 0.069mm씩 생장하였고, 안정적인 균주확보는 5주차 배양까지로 조사되었다.
C-15736-2×6, C-15746-2×4 균주를 이용하여 액체종균 제조에서 접종 균총의 적정 개수를 조사한 결과, 단포자 균주의 교배개수를 1×1로 하였을 경우 활력이 가장 양호하였다. C-15738-3×7을 포함한 4개의 균주를 이용하여 액체종균 제조에서 균총 접종비를 2:2, 1:3, 3:1로 하여 접종 균총의 적정 비율을 조사한 결과, 세 가지 조건에서 형성된 자실체의 활력 및 생물학적 효율(%)은 큰 차이가 없었다. C-15744-7, C-15747-3 균주를 이용하여 액체종균의 소량배양(250㎖)과 대량배양(8ℓ)에서 인공자실체의 활력을 비교한 결과, 두 가지 조건에서 형성된 인공자실체의 활력은 큰 차이가 없었으며 생물학적 효율(%)은 250㎖ 삼각플라스크 배양에서 2~3% 높게 조사되었다. C-15746-2×4 균주를 이용하여 인공재배에서 적정 수확시기를 조사한 결과, 안정적인 수확시기는 6, 7주로 조사되었다. 인공자실체의 활력은 7주차 배양에서 가장 양호하였고, 건중량 및 생물학적 효율(%)은 자실체의 배양기간에 반비례하였다.
The Cordyceps bassiana can be rarely collected in nature and is difficult to form artificial fruiting body. The study and use of Cordyceps bassiana is difficult because of such characteristics. This study analyzed mating type and conducted test of artificial culture by using strain that was separated from Cordyceps bassiana collected in Korea, and it kept strain continuously to make use of it as basic data of artificial culture.
The single ascospore strain separated from C-12511-6×9 and C-12511-8×9 in Entomopathogenic Fungal Culture Collection, Kangwon National University, Chuncheon, Korea(EFCC) was used to conduct test of mating and to select 12 strains including C-15736 and to repeat mating test. As many as 132 single spore strains were used to conduct mating test that 82% of all of the strains formed artificial fruiting body by mating of 'A and a' allele mating type of strains. Four of independently strains including C-15736 which formed artificial fruiting body were selected to separate single ascospore and then conduct mating test and to divide them into 'A and a' type and to form artificial fruiting body by A×a. In other words, multi ascospore was separated at separation of single ascospore. At the test, Cordyceps bassiana showed characteristics of heterothallic fungi. To investigate such a phenomenon, four of mixed strains C-15736-2×8 were selected to conduct test of female gamete and male gamete: The single ascospore strain that was firstly inoculated by culture medium making artificial fruiting body was found to be male gamete. Therefore, Cordyceps bassiana was found to be heterothallic fungi.
Not only three of multi ascospore strains including C-15739-6 but also mixed strains of both C-15736-2×6 and C-15746-2×4 commonly had low energy at primary subculture, and mixed strains had longer vitality than multi ascospore strains had. The secondary subculture of C-15741-6 was used to investigate artificial fruiting body depending upon hypha culture time of Petri-dish rack: The hypha grew up 0.069mm an hour, and stable strains were obtained by the 5th week culture.
Suitable number of normal flora at inoculation of liquid spawn by using C-15736-2×6 and C-15746-2×4 strain: 1x1 of mating number of single ascospore strain had the highest vitality. Moreover, suitable number of normal flora at inoculation of liquid spawn by using four strains including C-15738-3×7, have no significant difference at 2:2, 1:3, 3:1 inoculum rate conditions. The vitality of artificial fruiting body at both small quantity of culture and large quantity of culture of liquid spawn was investigated by using C-15744-7 and C-15747-3 strain showed no significant difference at both conditions and have 2-3% of biological efficiency(%) at 250㎖ Erlenmeyer flask culture. Suitable harvest time of artificial culture was investigated by using C-15746-2×4 strain to have either the 6th or the 7th week of stable harvest time. The vitality of the 7th week culture had the highest vitality of artificial fruiting body, and both dry weight and biological efficiency(%) were in inverse proportion to culture time of fruiting body.
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