Discovery of autocrine factor Midkine and evaluation of Neddylation Inhibitor MLN4924 using Patient-derived Glioblastoma Stem Cells = 환자 유래 교모세포종 줄기 세포를 이용한 자가 분비 인자 Midkine의 발굴 및 단백질 네딜화 억제제 MLN4924의 효능 평가
저자
발행사항
서울 : 성균관대학교 일반대학원, 2020
학위논문사항
학위논문(박사)-- 성균관대학교 일반대학원 : 융합의과학과 2020. 2
발행연도
2020
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
서울
형태사항
89 ; 26 cm
일반주기명
지도교수: 주경민
UCI식별코드
I804:11040-000000157094
DOI식별코드
소장기관
교모세포종은 매우 공격적이고 예후가 좋지 않은 뇌종양으로 치료 방법이 매우 제한적이다. 교모세포종 치료를 어렵게 하는 원인 중 하나는 교모세포종 줄기세포의 존재로 이 세포들은 스스로 성장 인자를 생산하여 암세포의 증식과 생존에 기여한다. 따라서 본 연구에서는 환자 유래 교모세포종 줄기세포의 중요한 자가 분비 인자를 발굴하고 해당 인자의 길항 효과를 평가하였다. 우선적으로 추가적인 성장 인자 없이도 줄기세포능을 유지하는 두 종의 환자 유래 교모세포종 줄기세포의 배지를 사용하여 단백질 분석을 수행하였으며, 분석된 단백질 중 임상적 중요성과 병리학적 연관성을 가지는 자가 분비 인자 Midkine (MDK)을 선정하였다. Midkine의 억제는 교모세포종 세포의 세포주기를 정지시키고, 산화 스트레스에 의해 유도된 DNA 손상으로 인한 세포 사멸을 유발하였다. 일부 환자 유래 교모세포종 줄기 세포는 Midkine 길항제 처리 시 저항성을 보이기도 하였으며, 유전체 정보 분석을 통해 이 저항성을 예측할 수 있는 분자 마커인 PCBP4를 확인하였다. 이 결과들은 Midkine의 억제가 교모세포종 세포의 증식을 저해함으로써 중요한 치료 선택권을 제공할 수 있음을 보여준다.
한편 최근의 암 연구 결과들은 단백질 네딜화 경로가 암에서 비정상적으로 활성화 되어 있으며 이 비정상적 활성화의 억제가 암 치료에 효과적임을 보여주었다. 교모세포종에서 역시 NEDD8 활성화 효소(NAE) 억제제인 MLN4924가 암세포의 생장 저해에 효과적이라는 연구 결과가 발표되었으나 그 효과는 교모세포종 세포주 모델에 한정되었기 때문에 저자는 고 함량 분석을 이용하여 4종의 교모세포종 세포주 및 15종의 환자 유래 교모세포종 줄기세포에서 MLN4924의 효능을 검증하였다. 분석 결과 정상 인간 성상 세포가 MLN4924에 내성을 보인 반면에 암세포에서는 생장이 저해되고 세포 사멸이 발생하였다. 특히 15종의 환자 유래 교모세포종 줄기세포에서는 세포마다 각기 다른 약물 반응성이 나타났다. MLN4924 민감성 세포군과 내성 세포군 간의 유전체 정보 분석을 수행한 결과, 민감성 세포군에서 ERK 및 AKT 신호전달 체계가 보다 활성화되어 있음이 확인되었다. MLN4924 내성 세포는 민감성 세포에 비해 ERK 및 AKT 신호 전달 체계에 낮은 의존도를 보였다. 이 연구 결과는 각 교모세포종 환자에 대한 MLN4924의 효능을 예측하는 지표로 사용될 수 있으며, 예측된 결과를 바탕으로 추가 약물을 이용한 병용 요법을 시행하여 치료 효과를 개선하는 데에 활용될 수 있을 것이다.
Glioblastoma is the most harmful and aggressive brain tumor with few treatment options. One of the major causes of glioblastoma treatment failure is the survival of glioblastoma stem cells. Glioblastoma stem cells produce their own growth factors that contribute to cell growth and survival. In this study, I identified an important autocrine factor of patient-derived glioblastoma stem cells and evaluated the effects of antagonism on glioblastoma survival. Preferentially, I performed protein analysis using media of two patient-derived glioblastoma stem cells which produced spheres without growth factors. Among the analyzed proteins, Midkine (MDK), which is a clinically important and pathologically relevant autocrine factor, was selected. Inhibition of Midkine arrested cell cycle of glioblastoma cells and caused cell death due to DNA damage induced by oxidative stress. Also I used bioinformatics analysis to identify PCBP4, a molecular factor that can predict anti- Midkine treatment resistance. These results showed that inhibition of Midkine could be important therapeutic option by suppressing the survival of glioblastoma cells. Meanwhile, recent cancer studies showed that abnormal modulation of neddylation pathway is associated with cancer progression. This pathway is also abnormally activated in glioblastoma. Many studies have shown that MLN4924, NEDD8-activating enzyme (NAE) inhibitor, reduces the growth of glioblastoma cells. However, because these studies were limited to cell line models, I validated the effects of MLN4924 in patient-derived glioblastoma stem cells. I treated MLN4924 on four glioblastoma cell lines and fifteen patient-derived glioblastoma stem cells and evaluated the efficacy of the drug through high content analysis. All of these cells showed decrease of viability by MLN4924, whereas normal human astrocytes were resistant to MLN4924. Especially, each patient-derived glioblastoma stem cells showed diverse drug reactivity upon MLN4924 treatment. I used bioinformatics analysis to identify genetic differences between the MLN4924 resistant and sensitive groups. Genomic analysis revealed that cells with higher activity of ERK-AKT signaling pathway were more sensitive to MLN4924. Treatment of MLN4924 in MLN4924 sensitive cells inhibits phosphorylation of ERK and AKT. The results of this study can be used to anticipate the efficacy of MLN4924 in patients with glioblastoma. Furthermore, based on the predicted results, combination therapy with additional drugs can be used to improve the therapeutic effect.
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