배양된 각막 실질세포에서 ceramide로 유발된 apoptosis = Ceramide-induced apoptosis in cultured keratocyte
저자
발행사항
울산 : 울산대학교 대학원, 2002
학위논문사항
학위논문(박사)-- 울산대학교 대학원: 의학과 2002. 8
발행연도
2002
작성언어
한국어
주제어
KDC
515.743 판사항(4)
발행국(도시)
울산
형태사항
vi, 27p. : 챠트, 사진 ; 29cm.
소장기관
Apoptosis는 이미 예정된 세포사의 한 과정으로, 조직 괴사(necrosis)와는 달리 주변 조직에 염증 반응을 일으키지 않고 개개의 세포가 제거 되는 과정으로 생각 되고 있다. Apoptosis를 유도하는 신호 전달 체계가 모두 밝혀지지는 않았으나, 최근 몇 년간 sphingolipid의 대사 산물인 Ceramide가 apoptosis를 매개하는 second messanger로 알려지고 있다. 각막상피 세포의 손상에 대한 반응으로 각막 간질세포의 소실이 생기며, 이는 apoptosis에 의해 매개된다. 기계적인 조작, 삼투압에 의한 탈수, 강력한 환경자극, virus에 의한 감염 등에 의해 각막상피 세포의 손상이 일어나면, 이어 각막 간질 세포의 apoptosis가 유발되며, apoptosis에 의해 각막 실질 세포가 제거된 후, 각막 상피세포의 과다 증식과 간질 세포의 재활성화 및 재형성이 일어나게 되고, 이로 인해 교원질이 포함된 세포외 기질의 과합성등이 유발된다. 본 연구에서는 각막실질세포의 apoptosis 과정에 ceramide가 관계하는지 여부와 어떤 경로를 통하여 apoptosis가 일어나는지에 대해 알아보고자 하였다. 1.5kg Newzealand White Rabbit 의 각막 간질세포를 배양한 후, ceramide type II 와 typeVI 와 phytoceramide type II 와 typeVI를 각각 10,20,40,80 μM 처리하여 24시간 배양 후 apoptosis를 평가 하였다. 살아 있는 세포 상태에서 Hoechst 염색을 하여, UV filter에서 형광 현미경으로 촬영하였고, Annexin V 염색을 하여, 광학 현미경하에서 관찰하였다. 각각의 ceramide 20μM를 처리하여 6, 12, 24시간에 대한 apoptosis를 조사하였다. CPP32-like protease inhibitor (Z-VAD-FMK)를 0, 10, 100, 1000, 10000nM의 농도로 사전 처리 후와, specific caspase-8 inhibitor (IETD-CHO)를 0, 50, 100μM의 농도로 사전 처리한 후, specific caspase-9 inhibitor (Z-LEHD-FMK)를 0, 50, 100, 200μM의 농도로 사전 처리한 후의 apoptosis를 평가하였다. Ceramide를 시간대 별로 처리한 후, Cytochrome C 면역 염색을 시행하였다. Apoptosis의 정도는 LDH의 activity를 검사하여 평가하였다. 4가지 종류의 ceramide 모두에서 20μ에서 apoptosis가 잘 유발이 되었다. Hoechst 염색시 대조군에 비해 ceramide의 처리 군에서 apoptosis가 일어난 세포에서 관찰 할 수 있는 응축되거나 쪼개진 핵을 더 많이 관찰할 수 있었고, Annexin V 염색시 phospatidylserine에 의해 생기는 세포막 주위의 작은 소포들이 관찰되는 소견을 보여 ceramide에 의해 apoptosis를 유발하는 것을 세포질과 세포막에서 확인할 수 있었다. Ceramide의 처리 시간이 증가 할수록 LDH의 acitivity가 증가하는 것으로 나타났다. 4가지 ceramide의 LDH activity가 CPP32-like protease inhibitor의 처리로 모두 억제되었다. Caspase-8 inhibitor의 처리로4가지 ceramide의 LDH activity가 모두 억제되었다. Ceramide를 처리한 각막 실질세포에서 cytochrome C 면역 염색에 양성 반응을 보였고, caspase-9 inhibitor의 처리로 약간의 LDH activity의 감소를 관찰하였다. 결론적으로 배양된 각막실질세포에서 ceramide에 의해 apoptosis가 유발 되었으며, 이는 caspase cascade 중, mitochondria를 거치는 pathway를 통해 일어남을 알 수 있었다.
Apoptosis is a process of programmed cell death. Unlike necrosis, apoptosis remove individual cells without causing surrounding tissue damage. Most of the signaling pathways that trigger apoptosis remain unknown; but during the last few days, ceramides, products of sphingolipid metabolism, have been recognized as second messenger mediating apoptosis. Many type of corneal epithelial injuries such as mechnical epithelial scrap, viral infection, dehydration have been shown to trigger keratocyte apoptosis. After keratocyte death, activated keratocyte replenish anterior stroma. These keratocyte have been associated with increased collagen deposition and collagen disoranization, epithelial hyperplasia. In this study, we investigated the effect of ceramide on keratocyte apoptosis and pathway of ceramide-induced keratocyte apoptosis. Keratocytes of Newzealand White Rabbit were cultured. We measured LDH level for evaluation of apoptotic response, and Hoechest stainining and Annexin V binding assay were done. Cultured keratocytes were exposed to 10,20,40 80 μM of ceramide type II, VI and phytoceramide type II , VI, then LDH level wasmeasured for the evaluation of time abd concentration related apoptosis. For the search of the pathway of ceramide-induced-apoptosis, keratocytes were preincubated in various concenturations of CPP32-like protease inhibitor(Z-VAD-FMK, diffuse caspase inhibitor), then 20 μM of 4 types of ceramide. After 12 hours, LDH assay was done. Keratocytes were preincubated in various concenturations of specific caspase-8 inhibitor(IETD-CHO) and specific caspase-9 inhibitor (Z-LEHD-FMK), then 20 μM of 4 types of ceramide. After 6 hours, LDH assay was done. Cytochome C immune stainining was done after expoure of keratocyte to 4 types of ceamides. Apoptosis of keratocyte was dependent on ceramide concenturation. The lower effective dose of 4 types of ceramide was 20μM. Shrinkage of cytoplasem, formation of apoptotic bodies, and nuclear fragmentation were observed on Hoechst stain. Small vesicles around cell membrane were observed on Annexin V stain. Keratocyte death was dependent on time. Ceramide induced keratocyte apoptosis was inhibited by CPP32-like protease inhibitor, specific caspase-8 inhibitor. Ceramide induced apoptotic keratocytes were immune-stained with cytochrome C antibody. Specific caspase-9 inhibitor also inhibited ceramide-induced keratocyte apoptosis. In conclusion, ceramide induced apoptosis in cultured corneal keratocyte. This apoptosis developed according cascade pathway, especially via mitochondria.
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