Promotion of bone repair by using RGD-grafted phosphatidylserine-containing liposomes = RGD가 결합된 포스파티딜세린 리포좀을 이용한 골형성 촉진
저자
발행사항
서울 : 서울대학교 대학원, 2022
학위논문사항
학위논문(박사)-- 서울대학교 대학원 : 치의과학과 치과생체재료과학 2022. 2
발행연도
2022
작성언어
영어
주제어
DDC
617.6
발행국(도시)
서울
형태사항
V, 53 ; 26 cm
일반주기명
지도교수: 양형철
UCI식별코드
I804:11032-000000169758
DOI식별코드
소장기관
대식세포는 염증과 상처 치유 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 널리 알려져 있다. 포스파티딜세린 함유 리포솜(PSLs)은 대식세포의 PS 수용체에 결합함으로써 사멸 세포의 면역 조절 효과를 모방할 수 있다. 이전 연구를 통해 항염증성 MGF-E8을 모방하는 RGD의 가능성이 in vitro 상에서 확인된 바 있다. 즉, RGD가 접목된 포스파티딜세린 함유 리포솜(RGD-PSLs)이 M1 분극을 감소시키고, M2 대식세포 레벨을 증가시켜 PSLs의 면역 조절 효과를 크게 향상시켰다. 골 치유 및 재생에서 M2 대식세포의 역할을 고려하여, 본 논문에서는 RGD-PSLs가 calvarial 결함 내에서 대식세포의 M2 분극화 향상을 통한 골 형성 촉진 가능성을 조사하였다.
본 연구에서는 이전 연구방법과 같이 PSLs와 3%-RGD-PSLs을 준비하였다. 제작 된 리포솜의 특성을 평가하기 위해, 리포솜이 갖는 형태, 크기 및 제타 전위 측정을 통해 물리적 특성을 확인하였다. αvβ3 인테그린의 길항항체를 사용하여 RGD-PSLs의 항염증 효과와 M2 대식세포 유도 효과에 대하여 대식세포의 인테그린과 RGD간의 상호작용이 관련됨을 확인하고, PS 수용체의 항체인 TIM-4, MerTK 및 BAI1을 사용하여 RGD-PSL의 효능을 평가하였다.
생체 내 실험에서는 나노하이드록시아파타이트, 리포솜, 젤라틴 및 알긴산 나트륨의 조합을 사용하여 복합 지지체를 제작한 후, 쥐의 두개골 결함에 이식하였다. 지지체 이식 후 1주째에 골 결손 부위의 대식세포 분극 마커인 CD68, iNOS 및 Arg-1 양성 세포의 면역조직화학적 염색을 수행하였고, 조직학적 분석을 위해 조직 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 Masson's trichrome 염색을 별도로 진행하였다. 그리고 2주 간격으로 10주 동안 생체 내 마이크로 CT 스캐너를 사용하여 종골 결손에서 새로운 골 형성을 관찰하였다.
리포좀의 구형 구조는 STEM 관찰에 의해 확인되었으며, 리포좀의 평균 크기는 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이가 없었다. 그러나 제타 전위 평가에서는 RGD의 첨가가 전위 변화를 유도하였다. αvβ3 인테그린 항체는 염증성 사이토카인의 발현에 대한 리포솜의 억제 효과를 부분적으로 차단하고 M2 분극을 감소시켰다. 또한 PS 수용체인 TIM-4, MerTK 및 BAI1의 길항항체가 대식세포에 대한 RGD-PSLs의 효과에 의해 부분적으로 저해되었다. 이러한 결과들은 PS 수용체와 인테그린이 집합적으로 RGD-PSLs의 효과에 기여함을 나타내는 것이다. 그리고 RGD-PCLs을 이용하여 RGD가 PS 분자 없이 항염증 효과를 발휘할 수 있는지 여부를 조사한 결과, PS가 없는 리포솜은 항염증 및 M2 유도 효과를 전혀 나타내지 않았다
면역화학적 염색결과, 1주차에서는 RGD-PSLs 군에서 M1 대식세포의 감소와 함께 M2 세포의 상당한 증가가 관찰되었다. 그러나 H&E 염색을 통한 조직학적 관찰에서는 PSLs 및 RGD-PSLs 그룹의 여러 표본에서 골와 같은 구조를 나타내는 작은 단편의 출현을 제외하고는 세 그룹 간에 유의미한 차이를 보이지 않았다. 따라서 골이식 수술 후 빠르면 1주일 정도부터 새로운 골 형성이 시작되었을 가능성이 있다고 할 수 있다. 10주에 모든 그룹에서 새로운 골 형성이 명확하게 보였고 결함의 상당 부분이 전형적인 새로운 골 구조로 대체되었다. 마지막으로, Micro-CT 결과를 통해 3%-RGD-PSL에 의해 새로운 골 형성이 더 높은 골 부피와 골밀도를 갖는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과들을 통해 RGD-PSLs의 강력한 면역조절 효과가 골조직 재생의 증진을 유도함을 시사하는 것이라 할 수 있다.
Macrophages are known to play an important role in the process of inflammation and wound healing. Phosphatidylserine containing liposomes (PSLs) can mimic the immunomodulatory effects of apoptotic cells by binding to PS receptors of macrophages. In our previous study, the potential of RGD to mimic anti-inflammatory MGF-E8 was investigated in vitro. The results indicated that RGD-grafted phosphatidylserine-containing liposomes (RGD-PSLs) significantly enhanced the immunomodulatory effect of PSLs by reducing M1 polarization, and increasing M2 macrophage levels. Considering the role of M2 macrophages in bone healing and regeneration, we expected RGD-PSLs to promote bone formation within calvarial defects via enhancement of M2 polarization of macrophages.
In this study, PSLs and 3%-RGD-PSLs were prepared according to our previous methods. To further investigate the properties of liposomes, the physical characteristics of liposomes with morphology, size and zeta potential were measured. The involvement of the interaction between RGD and integrin of macrophages in the antiinflammatory and M2-inducing effects of the RGD-PSLs was confirmed by using antagonistic antibody of αvβ3 integrin. The effects of RGD-PSLs were also confirmed by using the antibodies of PS receptors: TIM-4, MerTK, and BAI1.
In in vivo experiment, the composite scaffolds were fabricated using a combination of nanohydroxyapatite, liposomes, gelatin, and sodium alginate and implanted into rat calvarial defects. At 1-week postimplantation of scaffolds, Immunohistochemical staining of CD68, iNOS, and Arg-1 positive cells was performed for macrophage polarization markers in the bone defect area. For histological analysis, tissue sections were stained separately with hematoxylin and eosin (H&E) and Masson’s trichrome staining. New bone formation in calvarial bone defects was observed using an in vivo micro-CT scanner during 10 weeks at 2-week intervals.
The spherical structure of liposomes was confirmed by STEM observations and the average size of liposomes was no statistically significant difference among the groups. However, RGD grafting induced changes in the zeta potential. As the result showed, the antibody of αvβ3 integrin partially blocked the suppressive effects of liposomes on the expression of inflammatory cytokines and reduced M2 polarization. The effects of RGD-PSLs were also partially interfered with antibodies of PS receptors: TIM-4, MerTK, and BAI1. Those results indicate that the PS receptors and integrin collectively contribute to the immunomodulatory effect of RGD-PSLs. We also confirmed that the liposomes without PS did not exhibit antiinflammatory and M2 polarization effects at all.
In the calvarial defect model, a significant increase in M2 with a decrease in M1 macrophages was observed with 3%-RGD-PSL treatment compared with the effects of PSLs alone. Unlike the immunostaining of macrophage polarization, histological observations with H&E staining did not show any significant differences among the three groups, except for the appearance of small fragments exhibiting bone-like structures in several specimens from the PSL and RGD-PSL groups. The bone-like fragment was confirmed by Masson’s trichrome staining. Therefore, new bone formation was likely to have started as early as 1 week after the bone grafting surgery. At 10 weeks, new bone formation was clearly visible in all groups and a substantial area of the defect was replaced by a typical new bone structure. Finally, Micro-CT results showed that new bone formation was accelerated by 3%-RGD-PSLs with higher bone volume and bone mineral density. Thus, these results suggest that the intensive immunomodulatory effect of RGD-PSLs led to the enhancement of bone tissue regeneration.
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