Optimal Method of the Cryopreservation of Rat(Sprague Dowley) Hepatocytes for the Use of Primary Culture : 쥐 간세포의 일차배양을 위한 적정 냉동 보존 방법
저자
발행사항
서울 : 동국대학교 대학원, 1999
학위논문사항
Thesis(M.A.)-- 동국대학교 대학원: 응용생물학과 2000. 2
발행연도
1999
작성언어
영어
주제어
KDC
472.18 판사항(4)
발행국(도시)
대한민국
형태사항
vi, 50p. ; 26cm
일반주기명
References: p. 27-38
DOI식별코드
소장기관
쥐 간세포의 적정 냉동 방법을 위해 동결 속도, 동결 보존액의 조성, DMSO의 첨가 방법의 조건들을 조사하였다. 동결보존액의 조성에 따른 세포 생존율은 수동동결 방법을 사용했을 때 동결보존액 사이에서는 차이를 보이지 않았으나, MCM을 기본 배양액으로 사용하였을 경우에 α-MEM보다 생존율이 증가하였다. 그러나 수동동결 방법에서는 세포 생존율이 약 60%임에도 불구하고 세포 부착율은 1%미만이었다. DMSO는 일 단계 첨가보다는 이 단계 첨가 방법에서 세포 생존율이 현저히 증가하였다. 시간이 경과함에 따라 DMSO의 이 단계 첨가는 2시간까지도 생존율에 변화가 없었다. 세포를 자동 동결 프로그램으로 동결하였을 때 생존율이 77.8±1.7%로 수동동결에 비해 세포 생존율과 배양 부착율에서 우세하였다. 동결보존액내 세포 농도는 세포의 농도가 증가할수록 생존율이 감소하였다. 세포 농도는 1×107/ml이상의 사용은 적합하지 못하였다. 서로 다른 자동 동결 프로그램사이에서 프로그램 2보다 프로그램 1에서 생존율은 증가하였고 배양 부착율은 약 50% 정도의 비슷한 결과를 보였다. 배양 부착력은 percoll density purification의 사용으로 약 25% 이상 부착율을 향상시킬 수 있었다. 간세포를 위한 적정 동결 방법으로 동결 전 간세포의 세포 생존율과 배양 부착율을 비교해 보았을 때, 수동 동결방법은 간세포의 동결 방법으로 적합하지 못했으나, 자동동결 프로그램을 이용하여 동결하였을 때 가장 효과적으로 간세포를 동결 보존할 수 있었다.
더보기In order to develop an optimal cryopreservation we investigated a variety of factors including the cooling rate, the constituents of medium, the cryoprotective agents and thawing condition on thepreservation of rat hepatocytes. There are no difference in the viability of cells among various cryopreservation solutions with manual freezing method. The C3 solution increased the cell viability more than C4 solution using α-MEM (p=0.023) but there were no difference in the viability between C1 and C2 solutions. Although the cell viability was 60%, the attachment efficiency of the five cryopreservation solutions was less than 1%. Gradual addition of DMSO was found to be more suitable for the cryopreservation compound to one-step addition of DMSO. The viability was 73.3±2.5% with one-step addition of DMSO while it was 82.7±2.5% with the gradual addition of DMSO. However the gradual addition of DMSO did not alter this viability on ice for up to 2 hour (p=0.0423). Before cryopreservation the cell viability between one-step and gradual addition of DMSO was significantly different (p〈0.05). The viability of cryopreserved cells using the manual freezing was decreased with one-step addition in contrast with gradual addition of DMSO. However, there were no significant difference in the viability among one-step, the gradual addition and the removal of the cryoprotectant (p>0.05). At a cell concentration of 2×106/ml, the viability was 54.7±3.1% with the manual freezing while it was 77.8±1.7% with the computer freezing program-1. The difference between two freezing method and different cell concentration was significant(p〈0.05). The highest level of cell viability were obtained by cryopreserving at a cell concentration of 2×106/ml. After thawing cells the viability of cryopreserved cells with program-1 were 77.8%, and then the viability of purified cells by a percoll centrifugation were 81.3% on the average. The use of a percoll centrifugation after thawing could improve the culture plating efficiency about 25%(from 50% up to 75%) without the change of cell viability.
We have shown that rat hepatocyte can be successfully cryopreserved with a computer-controlled freezing program. This is an effective method for the cryopreservation and the recovery of viable rat hepatocytes.
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