Metabolically - engineered production of 2’-fucosyllactose in recombinant Corynebacterium species
저자
발행사항
서울 : 국민대학교 일반대학원, 2019
학위논문사항
학위논문(석사)-- 국민대학교 일반대학원: 바이오발효융합학과 바이오발효융합전공 2019. 8
발행연도
2021
작성언어
한국어
DDC
660.28449 판사항(23)
발행국(도시)
서울
기타서명
재조합 Corynebacterium species에서 2’-fucosyllactose의 대사공학적 생산
형태사항
xii, 54 p.: 삽화 ; 26 cm.
일반주기명
지도교수 : 박용철
참고문헌 : p.
UCI식별코드
I804:11014-200000220381
소장기관
우유에는 미량 존재하고 모유에 8% 정도 함유된 Oligosaccharides가 있다. 이를 Human milk oligosaccharides (HMOs) 모유당 이라고 한다. 1L당 5~10 g 정도 함유되어 있고 fucosylation 된 당과 sialylation 된 당이 주를 이루며 조합에 따라 다양한 종류가 있다. 모유당의 주된 기능은 프리바이오틱 기능으로 프로바이오틱스 들의 먹이가 되 장내세균총의 건강을 유지할 수 있다. 또한 면역조절 및 뇌 발달에 도움이 되는 것으로 알려져 있다. 그러나 HMOs는 모든 어머니가 만들 수 있는 것이 아니고 유럽 기준으로 80%의 인구만 생성이 가능하다고 보고되었다.
HMOs 중 가장 많은 구성을 차지하고 있는 물질이 2’-fucosyllactose이다. 현재 일부 제품에 적용되고 있지만 공급이 제한적이고 고가이기 때문에 소량만 함유되어 있다. 따라서 상업적 대량생산기술 개발이 요구되고 있다.
이번 연구에서는 C. ammoniagenes 균주를 이용한 2’-fucosyllactose의 생산과, 기존의 induction system을 대체하는 constitutive promoter system을 도입한 2’-FL 생산에 대한 연구를 하였다. C. glutamicum의 constitutive promoter가 C. ammoniagene에서 작동함을 확인하였고 기존의 C. glutamicum에서 사용하던 2-FL 생산 벡터가 C. ammoniagene에서 작동함을 확인하였다. 그러나 벡터의 프로모터인 Ptac을 constitutive promoter인 H4로 교체하였을 때 2-FL의 생산을 보이지 않았다.
다음으로 GTP의 재생을 강화하기위해 nucleoside diphosphate kinase (ndk) 유전자를 2’-FL 생산에 도입했다. C. ammoniagenes과 C. glutamicum에서 ndk 유전자를 추출했고 C. ammoniagenes과 C. glutamicum에서의 효과를 확인했다. 회분식 발효 결과 C. ammoniagenes에서의 ndk 유전자는 2’-FL생산에 영향을 미치지 않았다. C. glutamicum에서는 C. ammoniagenes 유래 ndk는 대조군대비 O.D의 감소를 보였으며 630 mg/l의 2’-FL을 생산했고 30%의 2’-FL 생산 증가를 보였다. 또한 C. glutamicum 유래 ndk는 대조군대비 O.D의 감소를 보였으며 665 mg/l의 2’-FL을 생산했고 37%의 2’-FL 생산 증가를 보였다.
C. glutamicum에서의 두번째 회분식 발효 결과 C. ammoniagenes 유래 ndk는 대조군대비 O.D의 감소를 보였으나 2’-FL을 생산에는 차이가 없었다. 또한 C. glutamicum 유래 ndk는 대조군대비 O.D의 감소를 보였으며 683 mg/l의 2’-FL을 생산했고 16%의 2’-FL 생산 증가를 보였다.
There are oligosaccharides that contain about 8% in mother’s milk and trace amounts in bovine milk. it is called Human milk oligosaccharides (HMO). It contains about 5 ~ 10 g/l, and fucosylated sugars and sialylated sugars are mainly composed. There are various kinds depending on the combination. The main function of HMOs are to feed the probiotics with the prebiotic function and to maintain the health of the intestinal flora. It is also known to help with immune regulation and brain development. However, it has been reported that HMOs cannot be produced by all mothers and only 80% of the European population can be produced. 2'-fucosyllactose is the most abundant constituent of HMO. Currently, it is applied to some products, but only a small amount because it is limited in supply and expensive. Therefore, the development of commercial mass production technology is required.
In this study, the production of 2'-fucosyllactose by C. ammoniagenes strain and the production of 2'-FL by incorporating a constitutive promoter system replacing the using induction system were studied. It was confirmed that C. glutamicum constitutive promoter works in C. ammoniagene. Ptac promoter was replaced with the constitutive promoter H4, but 2-FL was not produced.
Next, the nucleoside diphosphate kinase (ndk) gene was introduced into 2'-FL production to enhance GTP regeneration. The ndk gene was extracted from C. ammoniagenes and C. glutamicum, and the effect was confirmed with C. ammoniagenes and C. glutamicum. Batch fermentation of C. ammoniagenes did not affect the 2'-FL production of the ndk gene. C. glutamicum showed that the C. ammoniagenes derived ndk showed a decrease in OD compared to the control group, and produced 630 mg / l 2'-FL, and showed a 30% increase in 2'-FL production. In addition, C. glutamicum-derived ndk showed a decrease in OD compared to the control group, producing 665 mg / l 2'-FL, and showed an increase of 37% 2'-FL production.
As a result of the second batch fermentation with C. glutamicum, C. ammoniagenes-derived ndk showed a decrease in OD compared to the control group, but there was no difference in the production of 2'-FL. In addition, C. glutamicum-derived ndk showed a decrease in OD compared to the control group and producing 683 mg / l 2'-FL, and showed an increase of 16% 2'-FL production.
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