Effects of RhoA on phagocytosis and superoxide formation in macrophages : 대식세포의 식작용과 O_(2)^(-) 형성에 있어 RhoA의 역할에 관한 연구
저자
발행사항
춘천 : 翰林大學校 大學院, 2001
학위논문사항
Thesis(master's)-- 翰林大學校 大學院: 學科間協同科程 老化生命科學專攻 2002. 2
발행연도
2001
작성언어
영어
주제어
KDC
472.193 판사항(4)
발행국(도시)
대한민국
형태사항
59 p. : Illustrations ; 26 cm.
일반주기명
참고문헌: p. 52-55
소장기관
PART I.
대식세포에 의한 대식작용은 면역반응에 있어 매우 중요한 초기 단계이다. 비록 RhoA가 세포의 부착능을 조절한다고 잘 알려져 있지만, 대식세포가 과립의 결합과 대식작용에 있어 인테그린과 연관된 RhoA의 기능적인 역할은 아직 명확하지 않다. 그래서 우리는 RhoA의 특이적인 저해제인 C3-transferase를 사용해서, 인테그린에 의해 일어나는 작용에 있어 RhoA의 역할을 조사했다. J774 대식세포들안으로 C3-transferase를 도입하기 위해, C3 transferase 유전자는 HIV-1 Tat 단백질의 도입부분인 9개의 아미노산을 번역하고있는 유전자조각과 결합시켰다. Tat-C3 transferase 결합 단백질은 세포속으로 빠르게 도입되었고, 도입된 Tat-C3 는 in vivo 와 in vitro 방법 모두에서 SDS-전기 영동과 변성시키지 않은 전기영동에서의 RhoA의 이동을 변화시켰다. 이것은 Tat-C3 transferase 가 ADP-ribosylation에 의한 RhoA에 변형을 일으킨 것이다. 다음으로, 대식 세포에 도입된 Tat-C3 transferase 의 생리적인 효과를 실험했다. 세포안으로 도입된 Tat-C3는 FITC가 결합된 zymosan 과립의 식작용을 줄였고, fibrinogen이 도포되어있는 plate에 대한 부착능도 저해했다. Tat-C3 또한 대식세포의 세포밖에서의 과립의 결합을 저해했다. 이러한 결과들은 RhoA가 대식세포의 인테그린을 조절함으로서, 대식작용과 부착능에 관여하는 것으로 사료된다.
PART II.
Rho 족 단백질들은 Fc γ receptor (Fc γ R)와 integrin αмβ₂불리우는 complement receptor type 3 (CR3)에 의한 대식작용을 조절한다. 이러한 대식작용은 일련의 oxidative burst 를 수행하게 된다. 본 연구에서는 RhoA와 대식작용동안 일어나는 superoxide burst 와의 관련성을 실험했다. HIV-1의 도입 단백질인 Tat과 결합된 C3 transferase (Tat-C3 transferase) 에 의한 RhoA의 저해는, senun-, C3bi- 와 IgG- 로 식균된 과립들 (- opsonized particles or coated particles) 의 대식작용을 현저하게 감소 시켰다. Tat-C3 transferase에 의한 C3bi-coated particles 의 대식작용의 감소는 IgG-coated particles 보다 휠씬 컸다. Superoxide는 C3bi- 또는 IgG-coated particles 의 대식작용중에 다르게 생성되지만, Tat-C3 transferase에 의해 모두 완벽하게 저해된다. Superoxide의 생성은 in vitro 에서 GTF의 존재하에, 재조합된 GST-RhoA의 양과 밀접한 연관이 있었다. Superoxide의 제거제인 N-acetyl-L-cysteine (NAC) 과 superoxide 의 촉진제인 methylviologen (MV) 은 대식작용에 아무런 효과를 나타내지 못했다. 이것은 superoxide가 대식작용을 유도하는 2차 전달자가 아니라는 것을 말한다. Tat-C3 transferase는 p38 MAPK와 ERK1/2의 인산화를 감소시켰다. 하지만 JNK는 아무런 변화를 보이지 않았다. p38 MAPK의 기질로 알려진 p47^PHOX의 이동은, Tat-C3 transferase에 의해 저해되지 않았다. 하지만, 대식작용을 수행하던 대식세포의 lysate에 의한 GST-p47^PHOX 인산화는 TatC3 transferase에 의해 현저하게 줄어들었다. 이러한 결과들로 RhoA가 serum-, C3bi-, 와 IgG-opsonized particles의 대식작용중에 생겨나는 superoxide 형성에 밀접한 관련이 있고, p38MAPK 와 p47^PHOX의 활성에 관여하는 것으로 사료된다.
PART I.
Phagocytosis by macrophages is primarily important for the initial step in the immune responses. Although it is well known that RhoA regulates the cell adhesion, the functional roles of RhoA on the integrin-related association of particles to the macrophage and phagorytosis are not clearly understood yet. Therefore, we used C3-transferase, a specific inhibitor of RhoA, to investigate the possible roles of RhoA in the integrin-mediated process. To transduce the C3-transferase into the J774 macrophage cells, C3 transferase gene was fused with a gene fragment encoding the 9 amino acids protein transduction domain (RKKKRRQRRR) of HIV-1 Tat protein. Tat-C3 transferase fusion protein was readily introduced into cells, and the transduced Tat-C3 changed RhoA mobility on the native and SDS-PAGE electrophoresis in vivo and in vitro system, suggesting that Tat-C3 transferase modify the RhoA by ADP-ribosylation. Next, physiologcal effects of transduced Tat-C3 transferase on macrophage cells were assayed. Uptake of fluorescence isothiocyanate (FITC)-conjugated zymosan particles was reduced in macrophage cell, and the cell adhesion of macrophage cells to the fibrinogen-coated plate was also reduced when Tat-C3 transferase was introduced into the cells. Tat-C3 also inhibited extracellularly the association of particles to macrophages. These results suggest that RhoA regulates the phagocytosis and adhesion of macrophage mediated through integrin, and the association of particles to macrophage.
PART II.
Rho subfamily proteins regulate phagocytosis through Fc γ receptor (Fc γ R) and complement receptor type 3 (CR3). It was found that phagorytosis is subsequently accompanied by series of oxidative burst, in which Rac was essential for the control of oxidative burst catalyzed by NADPH oxidase. In the present study, we have examined whether Rho is associated with the superoxide burst reaction during phagocytosis. Inhibition of Rho by Tat-C3 exoenzyme (Tat-C3) which is a fusion protein of Tat penetratin domain of human immunodeficient virus-1 and C3 exoenzyme partially curtailed the phagocytosis of serum-, C3bi- and IgG-opsonized zymosans. However, inactivation of Rho by Tat-C3 resulted in the complete abrogation of superoxide formation during phagocytosis of both C3bi- and 1gG-opsonized zymosans, suggesting that Rho is essential for superoxide formation in macrophages, and that phagorytosis and superoxide formation may be regulated in different signal pathways although phagocytosis induced oxidative burst. Furthermore, the production of superoxide is closely correlated with the level of the recombinant GST-RhoA in the presence of GTP in vitro. On the other hand, both superoxide scavenger and generator had no effect on phagorytosis, suggesting that superoxide is not a second messenger for the induction of phagocytosis. Tat-C3 decreased the phosphorylation of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) and extracellular signaling regulated kirtase (ERK) 1/2, but not c-Jun NH₂-terminal kinase (JNK) during phagocytosis of serum-opsonized zymosans in macrophage, while Tat-C3 did not cause the translocation of p47PHOX, a component of NADPH oxidase. On the contrary, the phosphorylation of GST-p47^PHOX by the lysates of macrophages performing phagocytosis was markedly inhibited by Tat-C3. Taken together, it could be concluded that Rho plays an important role as a regulator in superoxide formation during phagocytosis of serum-, C3bi-, and 1gG-opsonized zymosans through activation of p38 MAPK and ERK1/2 in addtion to the phosphorylation of p47^PHOX.
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