신장 족세포에서 globotriaosylsphingosine에 의한 세포손상기전 연구 = A mechanism of globotriaosylsphingosine-induced podocyte injury
저자
발행사항
아산: 순천향대학교, 2020
학위논문사항
학위논문(석사)-- 순천향대학교 대학원 : 의과학과 2020. 2
발행연도
2020
작성언어
한국어
주제어
DDC
610 판사항(23)
발행국(도시)
충청남도
형태사항
v, 33 p.: 삽화, 도표; 26 cm
일반주기명
지도교수: 이은영
단면인쇄임
참고문헌: p. 29-30
UCI식별코드
I804:44009-200000287359
소장기관
파브리 (Fabry) 질병은 X염색체에 의해 유전되며 α-galactosidase A 효소의 부족으로 체내의 여러 장기 및 조직에 globotriaosylceramide (Gb3)가 축적되어 문제를 일으키는 질환이다. 신장에서는 주로 혈관 내피세포나 사구체 족세포에 축적되어 신장의 섬유화, 족세포의 손상, 단백뇨 증가와 세포외 기질의 증가 및 염증반응이 유발된다고 알려져 있다. 현재 파브리 질병은 부족한 효소를 보충해주는 것이 표준치료법으로 사용되고 있으나, 신장 손상을 완전히 호전시키지는 못하는 상태이다. Globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3)은 파브리 환자의 혈액 및 조직내에서 증가되는 당지질 중 하나로 효소 대체요법을 시작한 후에도 지속적으로 혈중에 과량으로 존재하여 신장세포손상을 유발할 것으로 생각되고 있다. 한편 신손상기전에서 receptor interacting serine/threonine kinase 3 (RIPK3)가 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀진 바 있다. 본 연구에서는 파브리 질병에 의한 신손상의 발생기전에서 RIPK3의 역할에 대해 알아보고자 하였다.
본 연구진은 생쥐의 복강내로 lyso-Gb3를 주입하여 파브리 모델을 만들었다. 신장의 형태학적인 변화는 광학현미경 및 전자현미경을 이용하여 관찰하였고, 24시간 소변에서 알부민과 크레아티닌 농도를 측정하여 비교하였다. 배양된 족세포에 lyso-Gb3를 처리하였고, RIPK3 억제제인 GSK′872를 처리하여 효과를 확인하였다. 단백질의 변화를 보기위해 웨스턴 블롯, 면역 형광염색을 수행하였으며, 활성산소 변화를 확인하기 위해 2′,7′-dichlorofluorescein (CM-H2DCF-DA) 염색을 하였다. 족세포의 기능적인 면을 확인하기 위해 콜라겐이 코팅된 transwell을 사용하여 알부민 투과성을 확인하였다.
연구결과 lyso-Gb3를 투여한 마우스 신장에서는 RIPK3발현이 증가하였고, 족세포 발현 단백질인 synaptopodin의 발현이 감소되었으며, 사구체 기저막 두께가 두꺼워지고 알부민뇨가 증가하는 경향을 보였다. Lyso-Gb3를 처리한 족세포에서도 RIPK3가 증가되었으며 섬유화 단백질인 피브로넥틴, 형질전환성장인자-베타, 4형 콜라겐과 활성산소가 증가하였다. 또한, 세포골격의 재배열과 알부민 투과성이 증가하였다. GSK′872 투여는 lyso-Gb3에 의해 증가된 섬유화 단백질과 활성산소 및 알부민 투과성을 감소시키고, 세포골격을 회복시켰다.
결론적으로, 파브리 질병에서 lyso-Gb3에 의한 족세포의 손상은 RIPK3에 의존적으로 발생하며, RIPK3는 파브리 신장병의 효과적인 치료 타겟으로 생각된다.
Podocyte injury is an early feature of Fabry nephropathy. Fabry disease is a rare X-linked lysosomal glycosphingolipid storage disorder resulting in the deficiency of the α-galactosidase A enzyme, eventually leading to end-stage renal disease. Globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) is a bioactive molecule that accumulates in Fabry disease. The receptor-interacting protein kinase-3 (RIPK3), a regulator of necroptosis, has been implicated in disease pathogenesis. However, the role of RIPK3 in the pathogenesis of Fabry nephropathy is largely unknown. Thus, we investigated a mechanism how RIPK3 is involved in lyso-Gb3-induced podocyte injury.
Cultured podocytes were stimulated with lyso-Gb3 (100nM, 200nM) to induce Fabry disease mimic condition. GSK′872 (10M), RIPK3 inhibitor, is used as a therapeutic agent. Intracellular reactive oxygen species (ROS) generation was analyzed using 2'-7' dichelorofluorescenin diacetate (CM-H2DCF-DA). Lyso-Gb3-induced podocyte injury was evaluated by western blot, immunofluorescence, and albumin permeability analysis.
Receptor interacting serine/threonin kinase 3 (RIPK3), necroptosis marker, was increased compared to the control group. Synaptopodin protein was significantly decreased and ROS was increased after lyso-Gb3 treatment. Lyso-Gb3 induced actin cytoskeleton rearrangement in podocyte. Lyso-Gb3 treated podocytes showed the increased albumin permeability. GSK′872 (RIPK3 inhibitor) reduced the fibrosis, ER stress and ROS protein expression in lyso-Gb3-induced podocytes. Lyso-Gb3-induced actin cytoskeleton rearrangement in podocytes was repaired by GSK′872. Furthermore, GSK′872 reduced lyso-Gb3-induced albumin permeability. These results suggest that GSK′872 has a therapeutic effect on lyso-Gb3-induced podocyte damage. These findings reveal a novel RIPK3 function in maintaining urinary filtration barrier integrity. RIPK3 may be a potential target for Fabry nephropathy.
In conclusion, GSK′872 ameliorates lyso-Gb3 induced podocyte injury. These results suggest that GSK′872 has a therapeutic effect on lyso-Gb3 induced podocyte injury.
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