Development and application of aptamer for medical use

국문 초록 (Abstract)

앱타머는 단일가닥의 핵산으로 이루어져있는 물질로서 그 자체의 구조를 이용하여 표적물질에 높은 결합력을 나타내는 물질이다. 앱타머는 항체에 비해 높은 안정성, 생산효율, 활용성 등에 대하여 장점을 가지고 있다. 이로 인해 앱타머는 항체를 대체할 수 있는 대안으로 새롭게 연구되고 있다. 본 연구에서는 이러한 앱타머를 활용하여 다양한 질병 치료에 접목하기 위한 기반소재로소 앱타머를 개발하고 응용하는 연구를 수행하였다.
현대 사회의 발전에 따라 많은 유해인자로 인해 많은 난치성질환 환자들이 발생하고 있다. 대표적으로는 암이 있으며, 암의 발생은 시간이 지남에 따라 기하급수적으로 증가하고 있는 추세이다. 대부분의 암은 초기 자각증상이 매우 미미하여 환자 스스로 병증을 확인할 수 없다는 특징을 가지고 있기에 많은 환자들이 암 말기에 암을 발견하여 치료시기를 놓치는 경우가 많은 실정이다. 이로 인해 암의 조기진단에 대한 중요성은 예로부터 강조되어 왔다. 본 연구에서는 상기한 앱타머 소재를 활용하여 간암 조기진단용 플랫폼을 구성하였다. 개발한 앱타머는 3D 모델링 기술을 통해 플랫폼을 구성하였으며, 이후 다양한 실험을 통해 실제 앱타머의 간암진단에 대한 기능성을 확인하였다. 이를 통해 개발된 앱타머는 향후 간암 조기진단용 플랫폼 제작과정의 기반기술로서 활용가치가 높을것으로 기대된다.
여드름은 3대 피부질환에 속하는 질환으로 남녀노소를 불문하고 많은 사람들이 겪고 있는 질환 중 하나이다. 이러한 여드름은 피부 각질의 축적이나 피지 과분비로 인해 발생하는 경우도 있지만 여드름 유발 균주가 모낭 속에 증식하며 일으키는 염증반응으로 인해 발생하는 경우도 매우 흔하게 나타난다. 이러한 여드름을 치료하기 위하여 여드름 유발 균주의 성장을 저해할 수 있는 앱타머를 개발하고자 하였다. 개발된 앱타머는 여드름 유발균주에 대한 성자 저해능을 확인하였다. 여드름 유발균주 특이결합 앱타머는 향후 앱타머 기반의 여드름 치료제의 중요한 기반소재로서 활용될 것이다.
다양한 질병의 치료과정에서 많은 화학적 항생제가 사용되고 있다. 이러한 화학적 항생제는 인체내에 잔류하며 다양한 부작용을 나타내게 된다. 이에 따라 많은 사람들이 화학적 항생제 사용에 대한 불안감을 가지고 있다. 이러한 화학적 항생제의 단점을 보완하고자 최근에는 많은 생물 유래 항생제에 대한 연구가 진행되고 있다. 생물 내에 자체적으로 존재하는 면역기작 중 하나인 항균펩타이드가 이 중 하나이다. 항균펩타이드는 화학적 항생제와는 다르게 인체내에 잔류하지 않아 부작용을 현저히 줄일수 있다는 장점을 가진다. 이러한 항균펩타이드를 산업적으로 활용하기에는 항균펩타이드의 대량확보가 필수적이다. 하지만 항균펩타이드 자체의 항균력으로 인해 박테리아를 이용한 대량발현이 어렵고 동물세포를 이요한 방법 또한 크로마토그래피를 이용한 정제과정에서 수율을 매우 낮고 펩타이드의 활성 또한 감소되게 된다. 이러한 항균펩타이드의 정제 및 확보과정을 보다 간단하고 효율적으로 하기 위해 앱타머를 이용한 펩타이드 정제기술을 개발하고자 항균펩타이드에 특이적으로 결합하는 앱타머를 개발하였다. 개발된 앱타머는 항균 펩타이드에 높은 친화도와 결합 특이성을 나타냄을 실험적으로 확인하였다. 이는 향후 항균펩타이드 대량정제과정에 중요한 기반소재로서 활용될 것으로 예상된다.
상기 연구들을 통하여 앱타머를 의료적 분야에 활용하기 위한 다양한 접근을 시도하였다. 간암의 조기진단을 위한 플랫폼 개발연구, 여드름 치료 소재 개발연구, 항균펩타이드 정제용 소재 개발연구를 수행함에 따란 많은 인류가 겪고 있는 질환들에 대해 앱타머를 이용한 해결책을 제시하고자 하였다. 이들 연구는 향후 추가적인 연구를 통해 다양한 의료분야에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

diagnostic technique for screening the presence or absence of a disease in a large number of people because it selects a high-risk group of a specific disease with high efficiency. Immunoassay methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), western blotting, fluoroimmunoassay, chemiluminescent immunoassay, and radioimmunoassay (RIA) have been developed and utilized.
Aptamer is a new material that can further simplify these diagnostic techniques and improve their detection capabilities. Aptamer has excellent binding power with target factors, easy chemical synthesis, high purity during synthesis, various necessary mutations through synthesis, and can be applied to various target substances through SELEX.
Since it has the advantage of hardly causing immune reactions and rejection reactions in the human body, research to use aptamer as a next-generation detection, diagnosis and treatment material that can replace current biological agents is led by research teams over the world.
GPC3 was selected as a new biomarker for early diagnosis of liver cancer, and an aptamer that specifically binds to it was developed. The developed aptamer planned the construction of a liver cancer diagnosis platform through 3D modeling technology. Subsequently, as a result of verifying the diagnosis of liver cancer, it was confirmed that GPC3 can be detected with high sensitivity. After that, it was confirmed that the functionality of the aptamer was maintained even at the level of mammalian cells.
Acne is one of the skin problems that many people suffer, and it is one of the diseases that are very difficult to treat effectively and completely. In most cases, such acne is caused by an inflammatory reaction caused by the proliferation of P.acnes, an acne-causing strain, in the skin follicle. If the proliferation of the acne-causing strain P.acnes can be suppressed, it will be possible to develop a very effective acne prevention and treatment. In this study, an aptamer that specifically binds to P.acnes was developed using an aptamer as a material for this purpose. In addition, it was verified that the developed P.acnes-binding aptamer can inhibit the proliferation of P.acnes.
Depending on the frequency of use of antibiotics, various side effects, such as inducing resistance and weakening of immunity, occur. However, since there is no other alternative, many people use antibiotics while suffering side effects. One of the substances that can replace these chemical antibiotics is antibacterial peptides derived from living organisms. Since these antimicrobial peptides are biologically derived, their biggest advantage is that they have less burden on the body and less side effects than chemical antibiotics. In order to expand the scope of use of these antimicrobial peptides, an aptamer that binds to antimicrobial peptides was developed.
This study deals with the medical application of aptamer as described above.

목차 (Table of Contents)

• Abstract 7
• List of tables 10
• List of figures 11
• 1. Overall research background 12
• 1.1 Early diagnosis of disease 13
• 1.2 Early cancer diagnosis 13
• 1.2.1 Cancer diagnostic markers and platforms 13
• 1.2.2 Early Cancer Diagnosis Research Trend 15
• 1.3 Features of aptamer material 16
• 1.3.1 Next-generation disease diagnosis and treatment material, aptamer 16
• 1.3.2 Advantages of Aptamer and its potential to be used as a material for diagnosis and treatment of diseases 17
• Ⅱ. aptamer for Detecting GPC3 in Hepatocellular Carcinoma and Molecular Docking Analysis of aptamer-GPC3 complexes 18
• 2.1.Introduction 19
• 2.2.Materials & Methods 22
• 2.2.1 Preparation of aptamers of for GPC3 detection 22
• 2.2.2 3D modeling for development of early liver cancer diagnosis platform through GPC3 detection 24
• 2.2.3 Quantitative measurement of aptamer affinity and experimental confirmation of binding affinity 25
• 2.2.4 Quantitative detection based on GPC3 binding aptamer 27
• 2.2.5 Verification of aptamer affinity and binding specificity at the level of mammalian cells 30
• 2.3.Results and Discussion 32
• 2.3.1 Progress and result of the SELEX experiment 32
• 2.3.2 Prediction aptamer 3-dimensioanl structure and docking simulation 37
• 2.3.3 Aptablotting assay for the GPC3-aptamer interaction 46
• 2.3.4 GPC3 detecting ALISA platform for early diagnosis of HCC 48
• 2.3.5 aptamer based Fluorescence imaging on GPC3 positive cells 50
• 2.4. Conclusion 57
• Ⅲ. Development of an aptamer material to inhibit the growth of P.acnes, the acne causative agent 58
• 3.1.Introduction 59
• 3.2.Materials & Methods 62
• 3.2.1 Establishment of anaerobic culture conditions for P.acnes 62
• 3.2.2 Production of DNA aptamer for selection of DNA aptamer that specifically binds to P.acnes 63
• 3.2.3 Selection of DNA aptamers that specifically bind to live P.acnes bacteria using SELEX technique 64
• 3.2.4 SELEX round selection for selection of optimal DNA aptamers that specifically bind to the surface of live P.acnes 66
• 3.2.5 SELEX round selection for selection of optimal DNA aptamers that specifically bind to the surface of live P.acnes using real-time PCR 67
• 3.2.6 Secure DNA aptamer candidates that specifically bind to liveP.acnes bacteria 67
• 3.2.7 Post-SELEX for comparison of the avidity between P.acnes and selected DNA aptamer candidate groups 68
• 3.2.8 Real-time PCR for comparing the avidity between P.acnes and selected DNA aptamer candidate groups 69
• 3.2.9 Quantification of affinity between live P.acnes bacteria and candidate P.acnes surface-specific DNA aptamers using SPR 69
• 3.2.10 P.acnes Growth Inhibition Experiment of P.acnes-specific DNA Aptamer 73
• 3.3 Results and Discussion 74
• 3.3.1 PCR amplification reaction and fabrication of single stranded DNA 74
• 3.3.2 Obtaining single strand DNA 75
• 3.3.3 Selection of the aptamer candidates 76
• 3.3.4 Development of Aptamer binding P.acnes using SELEX 76
• 3.3.5 Optimal round selection for obtain aptamer sequence by quantitative PCR 78
• 3.3.6 Sequencing for obtaining aptamer candidate 80
• 3.3.7 Screening P.acnes-aptamer candidate through post-SELEX 80
• 3.3.8 Measurement of binding affinity of aptamer candidates using SPR 83
• 3.3.9 P.acnes growth inhibition experiment using P.acnes aptamers 85
• 3.4 Conclusion 90
• Ⅳ. Evaluation of binding capacity and binding specificity of aptamer for expansion of the application range of antibacterial peptides (AMPs) 91
• 4.1.Introduction 92
• 4.2.Materials & Methods 99
• 4.2.1 Securing antibacterial peptides and tissue lysate 99
• 4.2.2 Random DNA library amplification through PCR technique 99
• 4.2.3 ssDNA fabrication using heating-cooling technique 99
• 4.2.4 Selection and recovery of ssDNA 100
• 4.2.5 Selection of DNA aptamer specifically binding to peptide using Ni-NTA agarose purification kit 101
• 4.2.6 Negative selection for removal of non-specific DNA aptamers 102
• 4.2.7 Affinity test of each round using nanodrops 103
• 4.2.8 T-vector cloning for DNA aptamer candidates that specifically bind to antimicrobial peptides 103
• 4.2.9 Quantification of affinity between peptide and DNA aptamer candidates using SPR 104
• 4.2.10 Apta dot-blotting using PG-1 aptamer 106
• 4.2.11 Apta dot-blotting using PMAP36 aptamer 107
• 4.2.12 Evaluation of binding specificity of antimicrobial peptide binding aptamer 107
• 4.3 Results and Discussion 109
• 4.3.1 Antimicrobial Peptide SELEX Optimal Round Selection 109
• 4.3.2 Quantification of affinity of antimicrobial peptide-binding aptamer candidates 112
• 4.3.3 Verification of binding affinity of PG-1 peptide aptamer 115
• 4.3.4 Evaluation of binding specificity of antimicrobial peptide binding aptamer 115
• 4.4 Conclusion 108
• Ⅴ. Conclusion 120
• Ⅵ. References 125