결핵균의 분자적 진단 효율성 향상을 위한 DNA 추출방법에 관한 연구 = Study on DNA extraction methods for enhancing efficiency of molecular detection of M. tuberculosis
저자
발행사항
김해 : 仁濟大學校 尖端産業技術大學院, 2004
학위논문사항
학위논문(석사)-- 인제대학교 첨단산업기술대학원: 임상생명공학전공 2004. 2
발행연도
2004
작성언어
한국어
주제어
KDC
511.57 판사항(4)
발행국(도시)
경상남도
형태사항
vi, 32p. : 삽도 ; 27cm .
일반주기명
참고문헌: p. 28-31
소장기관
결핵의 신속한 진단을 위하여 사용되는 중합효소연쇄반응(PCR) 법은 검체로부터 추출한 결핵균 DNA의 일부분을 증폭함으로써 기존의 방법에 비하여 보다 신속하고 예민한 방법임이 밝혀졌다. 그러나 PCR 법에 있어서 결핵균 검출율의 효율성은 가검물의 전처리 방법에 따라 그 결과가 매우 달라 사용에 어려움이 있어서, 결핵균 검출의 민감도가 높으며 재현성이 우수하고, 사용하기에 간단하며 신속한 결핵균 전처리 방법의 개발이 필요하다. 이에 결핵균의 PCR 법에 의한 진단 법 중 가장 민감도가 높은 것으로 나타난 대표적 방법인 boiling 법과 proteinase K-resin 법 두 가지를 선택하여 본 연구실에서 탐색, 개발된 reagent-X를 첨가한 새로운 DNA 추출 protocol에 의하여 준비된 결핵균 DNA의 IS 6110 sequence의 일부를 증폭하여 상호 비교함으로써 새로운 DNA 추출 방법의 민감도 향상 능력을 평가 하고자 하였다.
이를 위하여 사용된 표준 결핵균주(M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294)를 McFarland No. 0.5 혼탁도의 부유액으로 맞춘 후 phosphate buffered saline(PBS, pH 7 4)를 이용하여 10^(0) 부터 10^(-3) 희석농도로 10배수 계단 희석하여 boiling 법, proteinase K-resin 법, 그리고 각각의 방법을 개선한 B-X 법과 PR-X 법으로 DNA를 추출하여 중합효소연쇄반응을 시행한 후 전기영동을 하여 얻어진 그 성적을 비교 검토하였다. 그 결과 boiling 법과 proteinase K-resin 법은 10^(-5)과 10^(-6) 희석농도까지 DNA band를 관찰할 수 있어 전보에서 보인 민감도와 유사한 결과를 보였다. 그러나 B-X 법과 PR-X 법에 따른 결과는 각각 10^(-6) 희석농도와 10^(-7) 희석농도까지 DNA band를 보임으로서 기존의 boiling 법과 proteinase K-resin 법에 비해 한 단계 즉 약 10배의 민감도가 증가한 결과를 보였다.
여기에서 밝혀진 새로운 DNA 추출 방법이 임상 검체에서도 적용이 가능한지 알아보기 위하여 수행한 연구에서도 결핵균 진단의 민감도와 특이도, 그리고 positive 및 negative predictive value 등의 진단 효율성을 개선할 수 있어, 결핵의 확진 방법으로 배양 검사 법이 우수하다고 생각되지만 이는 6-8주나 소요된다는 점에서 조기 진단이 어려워 치료가 지연되는 단점이 있는 반면, PCR 검사 법을 이용하면 1-2일의 짧은 시간에 검사 결과를 알 수 있어 결핵 환자의 조기 진단 법으로 우수한 평가를 받을 수 있으므로 임상에 효과적으로 적용될 수 있는 것으로 판단된다.
이상의 결과, 본 연구에서 밝혀진 새로운 결핵균 DNA 추출 방법을 이용한 PCR 법은 배양 법에 준하는 결핵균의 분자적 진단의 민감도와 특이도, 그리고 양성 및 음성예측도 등의 진단 정확도를 보여, 보다 정확하고 신속한 결과 보고가 가능하여 결핵 퇴치에 효과적으로 적용될 것으로 기대된다.
The polymerase chain reaction(PCR) assay for diagnosis of tuberculosis is found to be more rapid and sensitive method than conventional diagnostic methods due to amplification of specific sequence on the DNA of Mycobacterium tuberculosis. However it is needed to develop a simple, rapid, sensitive, and reproducible method for the DNA extraction from clinical specimen, because the sensitivity and efficiency of the PCR-based molecular detection is mostly determined by quality and quantity of the extracted DNA. In order to meet this goal, it is designed to estimate whether the newly developed protocols, where the reagent-X used in this study is simply added into the two well-known, sensitive methods, boiling method and proteinase K-resin method, are capable of increasing the sensitivity of molecular detection of the mycobacterial DNA.
The suspension of a standard strain M. tuberculosis H37Rv(ATCC 27294) with turbidity of McFarland No. 0.5 was prepared and serial 10-fold dilution was made in phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4). Each series of concentrations was treated by boiling method, proteinase K-resin method and newly developed B-X method and PR-X method. The PCR was then performed with the extracted DNA samples, and their products were compared each other following gel electrophoresis. As results, the detection limits of the DNA extracted by the new methods, B-X method and PR-X method were UP tO 10^(-6), 10^(-7) dilution concentration, respectively, while the ones by boiling method and proteinase K-resin method were up to 10^(-5), 10^(-6) dilution concentrations, respectively, that are the similar levels reported previously. These results showed the new method could enhance the sensitivity of PCR-based detection of mycobacterial DNA about ten times compared to the other two conventional methods.
This new DNA extracting method was found to enhance sensitivity, specificity, and detection efficacy when it was applied with clinical specimens, suggesting its efficient application with clinical detection.
In conclusion, the newly modified DNA extraction method by adding reagent-X is verified as a very efficient and fast molecular method for detecting tuberculosis, implicating that it could be applicable to counteract against tuberculosis.
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