Studies on the Solubility Enhancer Vertor : Expression of Amidating Enzyme and Human IL-2 = 수용성 증강 벡터에 관한 연구 :아미데이팅 효소와 인터루킨 2의 발현
저자
발행사항
서울 : 연세대학교 대학원, 2002
학위논문사항
Thesis(Master)-- 연세대학교 대학원 : 생명공학과 2002.8
발행연도
2002
작성언어
-
주제어
발행국(도시)
대한민국
형태사항
67 ; 26cm
소장기관
The need for the efficient production of recombinant proteins continues to grow. Expression of recombinant proteins in bacteria often results in the accumulation of the protein products as insoluble deposits inside the cell, called inclusion bodies. To improve the solubility and the activity of the expressed proteins, we developed solubility enhancer vector, pGELysN, ased on the fusion of target protein to the N-terminal domain of E.coli lysyl tRNA synthetase, LysN.
Three target protesins, PHM (peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase, sCT (salmon calcitonin) and hIL-2 (human interleukin-2) were expressed by the pGELysN vector. The LysN-PHM fusion protein was highly expressed as soluble form in E.coli at lower temperature. The fusion protein was purified by nickel affinity chromatography to near homogeneity. The activity of the purified LysN-PHM protein was below detection level when analyzed by HPLC.
The fusion protein LysN-sCT was mainly expressed as insoluble form whereas the LysN-hIL2 was expressed very poorly.
Our experimental results demonstrate that solubility enhancer vector, that utilizes LysN as a novel fusion partner, can be usefully applied for expression of proteins that have been refractory to soluble expression in E.coli by conventional methods. The feasibility of the pGELysN fusion vector for expression of recombinant proteins for therapeutic purpose merits further investigation.
본 논문은 수용성 증강 벡터를 이용하여 기존에는 대장균에서 응집체의 형태로 발현되었던 중요한 효소인 아미데이팅 효소와 싸이토카인인 인터루킨 2를 수용성 형태로 발현시키기 위한 연구이다. 여러 가지 단백질들의 경우 좀더 효과적이고 저렴한 가격으로 생산하는 차세대 기술이 절실히 요구되는 바, 여러 가지 수용성 발현의 노력이 이루어지고 있다. 이러한 응집체의 단백질들을 활성이 있는 수용성 형태로 생산해 내기 위하여 융합짝으로 대장균 lysyl tRNA synthetase 의 아미노 말단인 LysN을 이용한 수용성 증강 벡터가 개발되었으며, 이 수용성 증강벡터를 사용하여 기존에는 대장균 발현 시스템에서 응집체의 형태로 나오던 아미데이팅 효소와 인터루킨 2를 수용성으로 발현시켰다. 아미데이팅 효소와 인터루킨 2를 클로닝한후 염기서열을 확인하였다. 아미데이팅 효소를 대장균 발현 시스템에서 저온 발현하였을 때는 수용성으로 발현되었지만, 효모 분비 발현 증강 벡터를 이용하여 효모발현 시스템에서는 발현되지 았았다. 인터루킨 2의 경우에는 수용성으로 발현되기는 하나, 발현 정도가 매우 낮았다. 발현된 아미데이팅 효소를 거의 균질하게 니켈 친화성 크로마토그래피로 분리하였으며, 분리되어진 LysN융합된 아미데이팅 효소를 고성능액체크로마토그래피로 효소활성 측정 실험을 해 본 결과, 효소의 활성은 거의 없는 것으로 나타났다. 수용성 발현이 항상 단백질의 원래 구조로의 접힘을 의미하지는 않는다. 비록 수용성으로 발현되어졌다 하더라도 안정된 원래 구조로의 접힘이 일어나지 않는다면 그 단백질은 활성을 잃을 것이다.
효소 활성 증강에 대한 연구는 앞으로 더 많이 이루어져야 할 것이며, 대장균 발현시스템에서 수용성 증강 벡터의 사용으로 인한 수용성 발현은 단백질 발현 시스템 뿐만 아니라, 분리 정제 시스템의 공정에도 굉장히 커다란 기여를 할 수 있는 가능성을 보였다.
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