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    Analysis of neuronal microcircuits and synaptic interactions

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    • CONTENTS
    • Ⅰ. CHARACTERIZATION AND USE OF MULTI-COLOR FLUORESCENCE MICRORO SCOPIC TECHNIQUES / M.W. WESSENDORF
    • 1. Introduction = 1
    • 2. Background : fluorescence and microscopy = 3
    • 2.1. Fluorescent dyes and their properties = 3
    • 2.2. Fluorescence microscopy = 7
    • 3. Specific methods in fluorescence microscopy = 11
    • 3.1. Tinctorial staining = 11
    • 3.2. Fluorescence tract-tracing techniques = 12
    • 3.3. Intracellular staining = 13
    • 3.4. Immunofluorescence histochemistry = 13
    • 3.4.1. Immunofluorescence methods = 13
    • 3.4.2. Combinations of immunofluorescence with other fluorecence techniques = 14
    • 3.4.3. Methods for simultaneous multi-color immunofluorescence histochemiistry = 15
    • 4. Characterization of methods using fluorescent substances = 16
    • 4.1. Characterization of fluorophores and filters in single-color fluorescence methods = 17
    • 4.2. Characterization of fluorophores and filters in multi-color fluorescence methods = 18
    • 4.2.1. Protocols for charaterization = 18
    • 4.2.2. Sources of lack of specificity in fluorophores = 18
    • 4.3. Characterization of immunofluorescence : single-color histochemistry = 23
    • 4.4. Characterization of immunofluorescence : multi-color histochemistry = 26
    • 4.5. The issue of detechability : when controls will not control = 31
    • 4.6. Abbreviated protocols for characterizing multi-color immunofluorescence = 32
    • 4.7. Multiple-labeling or apposition? = 34
    • 4.8. False negatives : the question of interferene = 35
    • 4.9. Remedies for lack of spcificity = 36
    • 4.9.1. Lack of specificity in fluorophores = 36
    • 4.9.2. Lack of specificity in antibodies = 37
    • 5. The future of multi-color fluorescence microscopy = 38
    • 5.1. Combinations of fluorescence microscopy with polarization microscopy = 38
    • 5.2. Conversion of fluorescent substances to electron dense substances = 38
    • 5.3. Use of primary antibodies raised in the same species for multi-color immunofluoresces = 38
    • 5.4. Use of primary antibodies in the species in which they were raised = 39
    • 5.5. Characterization of immunoreactivity = 39
    • 5.6. Development of new fluorescent labels = 40
    • 6. Development of new fluorescent labels = 40
    • 7. References = 41
    • Ⅱ. LIGHT AND ELECTRON MICROSCOPIC TRACING OF NEURONAL CONNECTIONS WITH PHASEOLUS VULGARIS-LEUCOAGGLUTININ(PHA-L), AND COMBINATIONS WITH OTHER NEUROANATIMICAL TECHNIQUES / H.J. GROEN E WEGEN ; F.G. WOUTERLOOD
    • 1. Introduction = 47
    • 1.1. Historical background = 47
    • 1.2. Recent developments = 48
    • 1.3. Tghe use of lectins as tracers = 49
    • 1.4. The tracing properties of the lectin Phaseouls vulgaris-leucoagglutinin(PHA-L) = 49
    • 1.5. Chemical characteristics of Phaseolus vulgaris-leucoagglutinin = 51
    • 2. Light microscopic tracing with PHA-L = 51
    • 2.1. Preparation of the tracer = 51
    • 2.2. Application of PHA-L = 52
    • 2.2.1. Iontophoresis = 52
    • 2.2.2. Effect of duration and strength of the current = 53
    • 2.2.3. Pressure injections = 55
    • 2.3. Histological and immunohistocemical preparation of the tissue = 55
    • 2.3.1. Fixation : how critical? = 55
    • 2.3.2. Immunohistochemical detection of injected PHA-L = 57
    • 2.3.3. Counterstaining, photography = 57
    • 2.4. Uptake and transport of PHA-L = 59
    • 2.4.1. Possible mechanisms of uptake = 59
    • 2.4.2. The injection site = 59
    • 2.4.3. Survival time = 61
    • 2.4.4. Retrograde transport = 65
    • 2.4.5. Uptake by fibers-of-passage = 69
    • 2.4.6. Transsynaptic transport = 69
    • 2.4.7. Maximum distance of transport from the injection site = 71
    • 2.4.8. Transport of PHA-L in peripheral nervous tissue = 71
    • 2.4.9. Neuron-, system- and species specificity = 71
    • 2.5. Quantification = 72
    • 3. Electron microscopy = 73
    • 3.1. Introduction = 73
    • 3.2. Technical considerations = 74
    • 3.2.1. Lines of approach = 75
    • 3.2.2. Light and electron microscopy of PHA-L labelled structures = 79
    • 3.2.3. Correlative light and electron microscopy = 81
    • 3.2.4. Location of the PHA-L taken up by neurons = 81
    • 3.2.5. Location of PHA-L in axon terminals = 82
    • 3.3. Concluding remarks = 82
    • 4. Combination of PHA-L tracing with other tracing techniques = 84
    • 4.1. Light microscopy = 84
    • 4.1.1. PHA-L and retrogrande tracing = 84
    • 4.1.2. PHA-L and intracellular injections = 89
    • 4.1.3. PHA-L and anterograde tracing = 89
    • 4.2. Electron microscopy = 89
    • 4.2.1. PHA-L and retrograde tracing = 89
    • 4.2.2. PHA-L as a postsynaptic marker in combination with anterograde degeneration = 89
    • 5. Combinations of PHA-L tracing with(immuno)histochemical procedures = 91
    • 5.1. Introduction = 91
    • 5.2. Double-labelling of fibers to show co-localization of PHA-L and a second marker = 92
    • 5.3. PHA-L tracing combined with enzyme histochemistry = 93
    • 5.4. PHA-L tracing in dual-label immunoperoxidase histochemistry = 93
    • 5.4.1. Priniple of the dual-label peroxidase immunohistochemistry = 95
    • 5.4.2. Control experiments = 95
    • 5.4.3. PHA-L tracing combined with dopamine(DA)-and GABA-immunohistochemistry = 97
    • 5.4.4. PHA-L tracing combined with choline acetyltransferase (ChAT)-immunocytochemistry = 99
    • 5.4.5. PHA-L tracing combined with peptide immunohistochemistry = 103
    • 5.5. Advantages and limitations of dual-labelling at the light microscopic level = 103
    • 5.6. Dual immunocytochemistry at the electron microscopic levels = 105
    • 5.6.1. Combination of PHA-L-tracing and pre-embedding immunocytochemistry = 105
    • 5.6.2. Combination of PHA-L-tracing and postembedding immunocytochemistry = 107
    • 6. Concluding remaks and further perspectives = 110
    • 6.1. Summary of advantages and limitations = 110
    • 6.1.1. Advantages = 110
    • 6.1.2. Limitations = 110
    • 6.2. Further perspectives = 111
    • 7. Acknowledgements = 111
    • 8. References = 112
    • 9. Protocols = 119
    • 9.1. Light microscopy = 119
    • 9.1.1. Protocol for standard light microscopic visualization of transported PHA-L = 119
    • 9.1.2. Protocol for the simultaneous detection of transported HPA-L and an antigen present in target structures ; PHA-L tracing and dopamine(DA)-immunocytochemistry = 120
    • 9.1.3. Protocol for the simultaneous detection of transported PHA-L and an antigen present in targets structures : PHA-L tracing combined with choline acetyltransferase(ChAT)-immunocytochemistry = 121
    • 9.2. Electron microscopy = 122
    • 9.2.1. Protocol for electorn microscopic tracing with PHA-L = 122
    • 9.2.2. Dual PHA-L tracing-immunocytochemistry at the electron microscopic level = 123
    • Ⅲ. COMBINED MORPHOLOGICAL AND HISTOCHEMICAL TECHNIQUES FOR THE STUDY OF NEURONAL MICROCIR CUITS / J.P. BOLAM ; C.A. INGHAM
    • 1. Introduction = 125
    • 1.1. Aims and organization of the chapter = 127
    • 2. Basic tools = 127
    • 2.1. The concept of correlated light and electron microscopy = 127
    • 2.1.1. Reasons = 128
    • 2.1.2. Procedure = 128
    • 2.2. Methods of neuron labeling for electron microscopy = 131
    • 2.2.1. Golgi-impregnation = 132
    • 2.2.2. Retrograde labelling = 139
    • 2.2.3. Labelling of neurons on the basis of chemical characteristics = 142
    • 2.3. Methods of characterization of terminals = 145
    • 2.3.1. Golgi-impregnation and electron microscopy = 145
    • 2.3.2. Anterograde degeneration of synaptic terminals = 146
    • 2.3.3. Anterograde labelling of synaptic terminals with HRP = 146
    • 2.3.4. Terminals labelled by the anterograde transport of Phaseolusvulgaris leucoagglutinin(PHA-L) = 147
    • 2.3.5. Immunocytochemistry and electron microscopy = 148
    • 3. Combinations of basic procedures to address questions of neuronal microcircuitry = 149
    • 3.1. What is the synaptic input and synaptic output of morphologically characterized neurons? = 150
    • 3.1.1. Combination of Golgi-impregnation and retorgrade transport of HRP(or conjugate) = 150
    • 3.1.2. Other approaches to address the question = 155
    • 3.2. What is the origin of the synaptic input and synaptic output of morphologically characterized neurons? = 158
    • 3.2.1. Combination of anterograde degeneration, retrograde labelling and Golgi - impregnation = 158
    • 3.2.2. Terminals labelled by anterograde transport of HRP(or conjugate) = 160
    • 3.2.3. Terminals labelled by the anteroprade transport of Phaseolusvulgaris leucoagglutionn(PHA-L) = 161
    • 3.3. What is the origin of the synaptic input of chemically characterized neurons? = 166
    • 3.3.1. Combination of anterograde degeneration and immunocytochemistry for cell bodies and dendrites = 166
    • 3.3.2. Combination of anterograde PHA-L and immunocytochemistry for cell bodies and dendrites = 167
    • 3.4. What is the chemical nature of projection neurons? = 168
    • 3.4.1. Retrograde transport of HRP(or conjugate) combined with immunocytochemistry of the same neuron = 168
    • 3.5. What is the synaptic input and synaptic output of morphologically and chemically characterized neurons? = 171
    • 3.5.1. Combination of immunocytochemistry and Golgi-impregnation = 173
    • 3.5.2. Combination of immunocytochemistry, Golgi-impregnation and retrograde labelling with HRP)(or conjugate) = 174
    • 3.6. What is the chemical nature of the synaptic input to morphologically characterized neurons? = 174
    • 3.6.1. Combination of immunocytochemistry for synaptic terminals, the retrograde transport of HRP(or conjugate) and Golgi-impregnation = 174
    • 3.7. What is the chemical nature of the synaptic input to chemically characterized neurons? = 179
    • 3.7.1. Double immunocytochemistry at the electron microscopic level = 179
    • 3.8. What is the nature of terminals converging on the one neuroal structure? = 183
    • 3.8.1. Double/triple immunocytochemisry at the electron microscopic level = 185
    • 3.8.2. Combination of anterograde degeneration of synaptic terminals with immunocytochemistry for a different class of terminals = 186
    • 3.8.3. Combination of anterograde degeneration, anterograde transport of HRP/WGA and Golgi-impregnation = 187
    • 3.9. What is the origin and chemical nature of synaptic terminals in contact with a particular class of neuron? = 187
    • 3.9.1. Combination of the anterograde transport of PHA-L or WGA/HRP with post -embedding GABA immunocytochemistry = 189
    • 4. Concluding remarks = 191
    • 5. Appendix 1 = 192
    • 5.1. Dehydration and embedding in resin for electron microscopy = 192
    • 6. Appendix 2 = 192
    • 6.1. Perfuse-fixation(rat) = 192
    • 7. References = 193
    • Ⅳ. SYNAPTIC INTERACTIONS BETWEEN CHEMICALLY DEFINED NEURONS : DUAL ULTRASTRUCTURAL IMMUNOCYTOCHEMICAL APPROACHES / A.N. VAN DEN POL ; C. DECAVEL
    • 1. Introduction = 199
    • 1.1. Organization of Chapter = 199
    • 2. Variables in immunocytochemistry = 200
    • 2.1. Immunoreagents = 200
    • 2.2. Fixation = 201
    • 2.3. Sectioning and embedding = 202
    • 2.4. Electron dense markers = 203
    • 2.4.1. Enzymatic labels = 204
    • 2.4.2. Metallic markers = 205
    • 2.4.3. Proteins and synthetic markers = 207
    • 2.4.4. Autoradiography = 207
    • 2.4.5. Fluorescent probes = 208
    • 3. Immunostaining for single antigens = 208
    • 3.1. Pre-embeddin peroxidase immunostaining = 209
    • 3.1.1. Peroxidase-antiperoxidase(PAP) immunostaining = 209
    • 3.1.2. Avidin-biotin-peroxidase complex(ABC) = 210
    • 3.1.3. HRP-labelled secondary antibody = 210
    • 3.1.4. Metallic intensification of peroxidase reaction product = 211
    • 3.1.5. Gold substituted silver peroxidase(GSSP) = 211
    • 3.1.6. Benzidine dihydrochloride(BDHC) immunostaining = 219
    • 3.2. Pre-embedding colloidal gold immunostaining = 220
    • 3.3. Pre-embedding silver intensified gold = 220
    • 3.3.1. Silver intensification of colloidal gold = 221
    • 3.3.2. SIG procedure = 222
    • 3.3.3. Immunostaining of tyrosine hydroxylase with gold particles = 222
    • 3.4. postembedding colloidal gold immunostaining = 226
    • 3.4.1. Method #1 = 227
    • 3.4.2. Method #2 = 229
    • 3.5. Immunostaining of ultrathin cryosections = 231
    • 4. Dual ultrastrctural immunostaining = 232
    • 4.1. Dual immunostaining with different size gold probes = 232
    • 4.1.1. Dual immunogold labelling with antisera from different species = 233
    • 4.1.2. Dual immunolabelling on opposit sides of a single grid = 234
    • 4.1.3. Gold label antigen detection(GLAD) = 237
    • 4.1.4. Dual immunostaining with protein A-colloidal gold = 238
    • 4.1.5. Dual immunolabelling on serial ultrathin sections = 239
    • 4.2. Dual immunostaining with pre-embedding peroxidase and post-embedding colloidal gold = 239
    • 4.2.1. Functional implications related to GABA and hypothalamic magnocellular neurosecretory neurons = 243
    • 4.3. Dual immunostaining with silver intensified gold and peroxidase = 244
    • 4.3.1. Role of GABA in endocrine regulation = 248
    • 4.4. Dual immunostaining with gold substituted silver peroxidase and DAB = 249
    • 4.4.1. Penetration and reliability of GSSP = 250
    • 4.4.2. Interactions between chemically defined neurons in the suprachiasmatic nucleus = 251
    • 4.5. Double enzymatic immunostaining with benzidine dihyudrochloride and diaminobenzidine = 251
    • 4.6. Combined autoradiography and immunocytochemistry = 256
    • 4.6.1. Light microscopy autoradiography = 257
    • 4.6.2. Electron microscopy radioautography = 257
    • 4.7. Ferritin and HRP = 260
    • 5. Acknowledgements = 260
    • 6. Appendix = 260
    • 6.1. Flat embedding of vibratome sections = 260
    • 6.2. DAB solution = 261
    • 6.3. Nickel-DAB solution = 261
    • 6.4. Uranyl acetate solution = 261
    • 6.5. Enriched phosphate buffer = 262
    • 6.6. Araldite embedding resin for post-embedding immunostaining = 262
    • 7. References = 262
    • Ⅴ. INTRACELLULAR INJECTION OF NEURONS IN FIXED BRAIN TISSUE COMBINED WITH OTHER NEUROANATOMICAL TECHNIQUES AT THE LIGHT AND ELEC TRON MICROSCOPIC LEVEL / E.H. BUH. ; W.K. SCHWERDTFEGER ; P. GERMROTH
    • 1. Introduction = 273
    • 2. Equipment = 274
    • 2.1. Injection set-up and micromanipulator = 274
    • 2.2. Pipette puller and iontophoretic pump = 275
    • 3. Methodological parameters = 275
    • 3.1. Fixation = 275
    • 3.1.1. Perfusion fixation = 275
    • 3.1.2. Immersion fixation = 276
    • 3.2. Preparation of slices = 276
    • 3.3. Preparation of mictopipettes = 277
    • 3.4. Injection technique = 279
    • 3.5. Staining mechanism : some considertions = 280
    • 3.6. Embedding procedure = 281
    • 3.7. Photooxidation : methodological procedure and possible mechanism = 283
    • 3.8. Photooxidation : methodological procedure and possible mechanism = 283
    • 3.9. Photooxidation : correlated light and electron microscopy = 284
    • 4. Methodological combinations at the light microscopic level = 287
    • 4.1. Retrograde tracing = 287
    • 4.2. Specific uptake of fluorescent markers = 291
    • 4.3. Visualization and uptake of neurotransmitters and analogs = 291
    • 4.4. Immunocytochemistry = 295
    • 4.4.1. Preservation of antigenicity = 295
    • 4.4.2. Processing of tissue and visualization of double-labelling = 295
    • 5. Methodological combinations at the electron microscopic level = 297
    • 5.1. Tracing neuronal chains by combining retrograde tracing, intracellular staining and anterograde degeneration at the electron microscopic level = 297
    • 5.2. Combination with immunocytochemistry = 299
    • 6. Concluding remarks = 299
    • 7. References = 300
    • Ⅵ. IMMUNOCYTOCHEMICALIDENTIFICAYTION OF ELECTROPHYSIOLOGICALLY CHARACTERIZED CELLS / K.G. SMITHSON ; G.I. HATTON
    • 1. Introduction = 305
    • 1.1. Studies of morphology and physiology = 305
    • 1.2. Emerging neurochemical domain = 306
    • 1.3. Objectives of integrated studies = 306
    • 1.4. Studies of morphology, physiology and neurochemistry = 307
    • 1.5. Chapter objectives = 307
    • 2. Combined electrophysiology and immunocytochemistry = 308
    • 2.1. Experimental background = 308
    • 2.2. Issues involved in the selection of methods = 309
    • 2.3. Overview of approach = 309
    • 2.4. Brain slice preparation = 310
    • 2.5. Intracellular recording and dye injection = 312
    • 2.6. Primary tissue fixation = 312
    • 2.7. observation of dye-filled cells in the whole slice = 312
    • 2.8. Secondary tissue fixation = 313
    • 2.9. Section preparation : polyethylene glycol embedding = 313
    • 2.9.1. Tissue dehydration = 315
    • 2.9.2. Tissue infiltration = 315
    • 2.9.3. Tissue embedding = 317
    • 2.9.4. Production of tissue sections = 317
    • 2.9.5. Polyethylene glycol removal = 319
    • 2.10. Identification of sections containing dye-filled cells = 320
    • 2.11. Immunocytochemical identification of antigens of interest = 321
    • 2.11.1. Immunocytochemistry = 321
    • 2.11.2. Chromogen reaction = 322
    • 2.12. Identification of double labelled cells = 322
    • 2.13. Alternative immunocytochemical methods = 323
    • 3. Immunocytochemically identified cells = 323
    • 4. Identification of chief methodological concerns = 324
    • 4.1. Physiological preparations = 328
    • 4.2. Cell marking compounds = 331
    • 4.3. Fixation = 333
    • 4.4. Whole slice observation = 334
    • 4.5. Section preparation = 334
    • 4.6. Cell recovery = 336
    • 4.7. Methods of chemical identification = 336
    • 4.8. Identification of double labelled cells = 337
    • 4.9. Control procedures = 338
    • 4.10. Strategies for adapting these techniques = 338
    • 5. Summary = 338
    • 6. Acknowledgements = 339
    • 7. Appendix = 339
    • 7.1. Summary of methods = 339
    • 7.1.1. Full method(for identification of one or more substances) = 339
    • 7.1.2. Abbreviated method(for identification of a single antigen(positive0only)in thick section) = 340
    • 7.2. Solutions = 341
    • 7.2.1. Artificial cerebral spinal fluid(ACSF) = 341
    • 7.2.2. Chrome-alum slide coating solution = 341
    • 7.2.3. Poly-L-lysine slide coating solution = 341
    • 7.2.4. Bouin's fixative = 341
    • 7.2.5. Chromogen mixture = 341
    • 7.3. Manufactured devices = 342
    • 7.3.1. Section positioning tools = 342
    • 7.3.2. Multi-welled tray = 342
    • 7.3.3. Buffer bath = 342
    • 7.3.4. Infiltration boats = 342
    • 7.3.5. Acetate strip = 343
    • 7.4. Photographic methods = 343
    • 7.5. Troubleshooting = 343
    • 8. References = 346
    • Ⅶ. ANATOMICAL ANALYSIS OF ELECTROPHYSIOLOGICALLY CHARACTERIZED NEURONS IN THE RAT STRIO-PALLIDAL SYSTEM / H.T. CHANG ; C.J. WILSON
    • 1. Introduction = 351
    • 2. Normal intracellular recording and labeling studies = 352
    • 2.1. Background = 352
    • 2.1.1. Cell types in the striatum = 352
    • 2.1.2. Electron microscopic analysis of striatal neurons = 353
    • 2.1.3. Anatomy and physiology of striatal afferents = 354
    • 2.2. Materials and methods = 355
    • 2.3. Results = 357
    • 2.3.1. Spontaneous firing patterns of neostriatal neurons = 357
    • 2.3.2. The axonal arborizations of the spiny neurons = 358
    • 2.3.3. Intracellularly labelled striatal efferent axons = 363
    • 2.3.4. Afferent input to the spiny projection neurons = 367
    • 2.3.5. Intracellular labelling of other types of striatal neurons = 372
    • 3. Combining intracellular labelling with other anatomical techniques : immunocytochemistry, anterograde and retrograde tracing = 374
    • 3.1. Rationale = 374
    • 3.2. Factors to be considered = 375
    • 3.3. Intracellular labelling combined with immunocytochemistry = 375
    • 3.3.1. Relationships of intracellularly labelled striatal cells with the striatal patch-matrix compartments = 376
    • 3.3.2. Relationships of intracellularly labelled pallidal neurons with immunocytochemically labelled terminals = 379
    • 3.4. Compatibility of intracellular labelling with other anatomical methods = 382
    • 3.4.1. Relationship with retrogradely labelled projection neurons = 382
    • 3.4.2. Relationships with anterogradely labelled affernet fibers = 384
    • 3.4.3. Intracellular labelling combined with AChE histochemistry = 384
    • 4. Technical considerations = 386
    • 4.1. Tips and trouble-shooting on normal intracellular injection of tracers = 386
    • 4.2. Tips on light and electron microscopic analyses = 388
    • 4.3. Intracellular labelling combined with immunocytochemistry = 389
    • 4.3.1. Pre-embedding immunogold procedures = 389
    • 4.3.2. Post-embedding immunogold procedures = 392
    • 4.4. Intracellular labelling combined with other anatomical techniques = 393
    • 4.4.1. Intracellular labelling and retrograde labelling = 393
    • 4.4.2. Intracellular labelling and anterograde labelling = 394
    • 5. Acknowledgements = 395
    • 6. References = 395
    • Ⅷ. CONVERGENCE OF MORPHOLOGICAL, PHYSIOLOGICAL AND IMMUNOCYTOCHEMICAL TECHNIQUES FOR THE STUDY OF SINGLE MAUTHNER CELLS / H. KORN ; D.S. FABER ; A. TRILLER
    • 1. Introduction = 403
    • 2. General properties of the M-cell = 404
    • 2.1. Identification of the M-cell = 404
    • 2.1.1. Morphological criteria = 404
    • 2.1.2. Note on axonal studies = 405
    • 2.2. Electrophysiological landmarks = 407
    • 2.3. Classification of afferent synapses = 408
    • 2.3.1. General features = 408
    • 2.3.2. Technical aspects of fish studies = 408
    • 2.3.3. Distribution of endings = 411
    • 3. Microcircuitry of a command neuron : relations with a stereotyped behavior = 412
    • 3.1. Excitatory inputs = 412
    • 3.2. Inhibitory inputs = 413
    • 3.2.1. Technical comments relative to HRP = 413
    • 3.2.2. General description = 413
    • 3.2.3. Quantitative analysis of branching patterns = 415
    • 3.3. Organization of a sensory network = 417
    • 4. Field effects : unconventional neuro-neuronal interactions? = 419
    • 5. Chemical transmission : identification and functions of neurotransmitters = 421
    • 5.1. Note on general immunocytochemical techniques = 423
    • 5.2. Glycine : a complete example of convergence = 427
    • 5.3. γ-Aminobutyric acid and dendritic inhibition = 428
    • 5.4. Serotonin : chemical definition of an afferent pathway = 428
    • 5.4.1. Histological methods = 429
    • 5.4.2. Morphological features of 5-HT afferents = 429
    • 5.4.3. Physiological consequences = 431
    • 5.5. Colocalization of classical transmitters = 433
    • 5.5.1. GABA and glycine = 433
    • 5.5.2. Serotonin and glycine = 434
    • 5.5.3. Evaluation of function = 434
    • 6. Chemical transmission : quantal mode of release = 435
    • 6.1. Quantal analysis in the light of morphology = 435
    • 6.1.1. Morphological significance of a mathematical term = 437
    • 6.1.2. Validation of the method and the one vesicle term = 439
    • 6.2. Ultrastructure of active zones and definition of a synaptic unit = 441
    • 6.2.1. Techniques for studies of presynaptic specializations = 443
    • 6.2.2. Active zones at inhibitory synapses = 443
    • 6.2.3. Definition of a synaptic unit = 444
    • 6.3. Significance of probabilistic release for hard-wired connectivity = 444
    • 6.4. Dynamics of the presynaptic grid during release = 449
    • 6.4.1. Technical aspects for studies of exocytosis = 449
    • 6.4.2. Changes in morphology with release = 450
    • 7. Chemical transmission : interaction between related systems = 451
    • 7.1. Homosynaptic synergism due to lateral diffusion of glycine = 451
    • 7.2. Heterosynaptic interactions involving glycine = 453
    • 8. Cell biology and development = 453
    • 8.1. Regulation of membrane properties = 453
    • 8.1.1. Techniques for axotomy = 453
    • 8.1.2. Axonal regeneration and survival following lesions = 455
    • 8.1.3. Maintenance of the cell body in an altered state = 455
    • 8.2. Structural aspects of the cytoplasm = 457
    • 8.2.1. Method for dissection of the M-cell = 457
    • 8.2.2. M-cell cytoskeleton = 459
    • 8.3. Experimental embryology and development = 459
    • 8.3.1. Early events of M-cell appearance and outgrowth = 459
    • 8.3.2. Environmental controls = 461
    • 8.4. Relation of the M-cell with other classes of medullary neurons = 463
    • 8.4.1. Further homologies with reticulospinal cells = 464
    • 8.4.2. An immunological marker = 465
    • 9. Conclusion = 467
    • 10. References = 468
    • Ⅸ. IN SITU HYBRIDIZATION HISTOCHEMISTRY / W. SCOTT YOUNG Ⅲ
    • 1. Introduction = 481
    • 2. Technical aspects = 482
    • 2.1. Tissue preparation = 482
    • 2.2. Hybridization = 482
    • 2.3. Probes = 483
    • 2.4. hybrid detection = 484
    • 2.5. Quantitation of hynridization = 487
    • 2.6. Specificity of hybridization = 490
    • 2.7. In situ hybridization histochemistry used with other anatomical techniques = 491
    • 3. Applications = 493
    • 4. Acknowledgements = 495
    • 5. Appendix Ⅰ - protocols = 497
    • 6. Appendix Ⅱ - protocol for non-radioactive detection of digoxigenin-labeled oligonucleotide probes = 501
    • 7. Appendix Ⅲ - protocol for non-radioactive detection of biotin-labelled oligonucleotide probe = 503
    • 8. Appendix Ⅳ - protocols for combining in situ hybridization histochemistry with immunohistochemistry or retrograde tract-tracing = 503
    • 9. Appendix Ⅴ - glossary = 506
    • 10. References = 506
    • SUBJECT INDEX = 513
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              학술연구정보서비스 이용약관 (2017년 1월 1일 ~ 현재 적용)

              1. 제 1 장 총칙

                1. 제 1 조 (목적)

                  • 이 약관은 한국교육학술정보원(이하 "교육정보원"라 함)이 제공하는 학술연구정보서비스의 웹사이트(이하 "서비스" 라함)의 이용에 관한 조건 및 절차와 기타 필요한 사항을 규정하는 것을 목적으로 합니다.
                2. 제 2 조 (약관의 효력과 변경)

                  1. ① 이 약관은 서비스 메뉴에 게시하여 공시함으로써 효력을 발생합니다.
                  2. ② 교육정보원은 합리적 사유가 발생한 경우에는 이 약관을 변경할 수 있으며, 약관을 변경한 경우에는 지체없이 "공지사항"을 통해 공시합니다.
                  3. ③ 이용자는 변경된 약관사항에 동의하지 않으면, 언제나 서비스 이용을 중단하고 이용계약을 해지할 수 있습니다.
                3. 제 3 조 (약관외 준칙)

                  • 이 약관에 명시되지 않은 사항은 관계 법령에 규정 되어있을 경우 그 규정에 따르며, 그렇지 않은 경우에는 일반적인 관례에 따릅니다.
                4. 제 4 조 (용어의 정의)

                  이 약관에서 사용하는 용어의 정의는 다음과 같습니다.
                  1. ① 이용자 : 교육정보원과 이용계약을 체결한 자
                  2. ② 이용자번호(ID) : 이용자 식별과 이용자의 서비스 이용을 위하여 이용계약 체결시 이용자의 선택에 의하여 교육정보원이 부여하는 문자와 숫자의 조합
                  3. ③ 비밀번호 : 이용자 자신의 비밀을 보호하기 위하여 이용자 자신이 설정한 문자와 숫자의 조합
                  4. ④ 단말기 : 서비스 제공을 받기 위해 이용자가 설치한 개인용 컴퓨터 및 모뎀 등의 기기
                  5. ⑤ 서비스 이용 : 이용자가 단말기를 이용하여 교육정보원의 주전산기에 접속하여 교육정보원이 제공하는 정보를 이용하는 것
                  6. ⑥ 이용계약 : 서비스를 제공받기 위하여 이 약관으로 교육정보원과 이용자간의 체결하는 계약을 말함
                  7. ⑦ 마일리지 : RISS 서비스 중 마일리지 적립 가능한 서비스를 이용한 이용자에게 지급되며, RISS가 제공하는 특정 디지털 콘텐츠를 구입하는 데 사용하도록 만들어진 포인트
              2. 제 2 장 서비스 이용 계약

                1. 제 5 조 (이용계약의 성립)

                  1. ① 이용계약은 이용자의 이용신청에 대한 교육정보원의 이용 승낙에 의하여 성립됩니다.
                  2. ② 제 1항의 규정에 의해 이용자가 이용 신청을 할 때에는 교육정보원이 이용자 관리시 필요로 하는
                    사항을 전자적방식(교육정보원의 컴퓨터 등 정보처리 장치에 접속하여 데이터를 입력하는 것을 말합니다)
                    이나 서면으로 하여야 합니다.
                  3. ③ 이용계약은 이용자번호 단위로 체결하며, 체결단위는 1 이용자번호 이상이어야 합니다.
                  4. ④ 서비스의 대량이용 등 특별한 서비스 이용에 관한 계약은 별도의 계약으로 합니다.
                2. 제 6 조 (이용신청)

                  1. ① 서비스를 이용하고자 하는 자는 교육정보원이 지정한 양식에 따라 온라인신청을 이용하여 가입 신청을 해야 합니다.
                  2. ② 이용신청자가 14세 미만인자일 경우에는 친권자(부모, 법정대리인 등)의 동의를 얻어 이용신청을 하여야 합니다.
                3. 제 7 조 (이용계약 승낙의 유보)

                  1. ① 교육정보원은 다음 각 호에 해당하는 경우에는 이용계약의 승낙을 유보할 수 있습니다.
                    1. 1. 설비에 여유가 없는 경우
                    2. 2. 기술상에 지장이 있는 경우
                    3. 3. 이용계약을 신청한 사람이 14세 미만인 자로 친권자의 동의를 득하지 않았을 경우
                    4. 4. 기타 교육정보원이 서비스의 효율적인 운영 등을 위하여 필요하다고 인정되는 경우
                  2. ② 교육정보원은 다음 각 호에 해당하는 이용계약 신청에 대하여는 이를 거절할 수 있습니다.
                    1. 1. 다른 사람의 명의를 사용하여 이용신청을 하였을 때
                    2. 2. 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재하였을 때
                4. 제 8 조 (계약사항의 변경)

                  이용자는 다음 사항을 변경하고자 하는 경우 서비스에 접속하여 서비스 내의 기능을 이용하여 변경할 수 있습니다.
                  1. ① 성명 및 생년월일, 신분, 이메일
                  2. ② 비밀번호
                  3. ③ 자료신청 / 기관회원서비스 권한설정을 위한 이용자정보
                  4. ④ 전화번호 등 개인 연락처
                  5. ⑤ 기타 교육정보원이 인정하는 경미한 사항
              3. 제 3 장 서비스의 이용

                1. 제 9 조 (서비스 이용시간)

                  • 서비스의 이용 시간은 교육정보원의 업무 및 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간(00:00-24:00)을 원칙으로 합니다. 다만 정기점검등의 필요로 교육정보원이 정한 날이나 시간은 그러하지 아니합니다.
                2. 제 10 조 (이용자번호 등)

                  1. ① 이용자번호 및 비밀번호에 대한 모든 관리책임은 이용자에게 있습니다.
                  2. ② 명백한 사유가 있는 경우를 제외하고는 이용자가 이용자번호를 공유, 양도 또는 변경할 수 없습니다.
                  3. ③ 이용자에게 부여된 이용자번호에 의하여 발생되는 서비스 이용상의 과실 또는 제3자에 의한 부정사용 등에 대한 모든 책임은 이용자에게 있습니다.
                3. 제 11 조 (서비스 이용의 제한 및 이용계약의 해지)

                  1. ① 이용자가 서비스 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 온라인으로 교육정보원에 해지신청을 하여야 합니다.
                  2. ② 교육정보원은 이용자가 다음 각 호에 해당하는 경우 사전통지 없이 이용계약을 해지하거나 전부 또는 일부의 서비스 제공을 중지할 수 있습니다.
                    1. 1. 타인의 이용자번호를 사용한 경우
                    2. 2. 다량의 정보를 전송하여 서비스의 안정적 운영을 방해하는 경우
                    3. 3. 수신자의 의사에 반하는 광고성 정보, 전자우편을 전송하는 경우
                    4. 4. 정보통신설비의 오작동이나 정보 등의 파괴를 유발하는 컴퓨터 바이러스 프로그램등을 유포하는 경우
                    5. 5. 정보통신윤리위원회로부터의 이용제한 요구 대상인 경우
                    6. 6. 선거관리위원회의 유권해석 상의 불법선거운동을 하는 경우
                    7. 7. 서비스를 이용하여 얻은 정보를 교육정보원의 동의 없이 상업적으로 이용하는 경우
                    8. 8. 비실명 이용자번호로 가입되어 있는 경우
                    9. 9. 일정기간 이상 서비스에 로그인하지 않거나 개인정보 수집․이용에 대한 재동의를 하지 않은 경우
                  3. ③ 전항의 규정에 의하여 이용자의 이용을 제한하는 경우와 제한의 종류 및 기간 등 구체적인 기준은 교육정보원의 공지, 서비스 이용안내, 개인정보처리방침 등에서 별도로 정하는 바에 의합니다.
                  4. ④ 해지 처리된 이용자의 정보는 법령의 규정에 의하여 보존할 필요성이 있는 경우를 제외하고 지체 없이 파기합니다.
                  5. ⑤ 해지 처리된 이용자번호의 경우, 재사용이 불가능합니다.
                4. 제 12 조 (이용자 게시물의 삭제 및 서비스 이용 제한)

                  1. ① 교육정보원은 서비스용 설비의 용량에 여유가 없다고 판단되는 경우 필요에 따라 이용자가 게재 또는 등록한 내용물을 삭제할 수 있습니다.
                  2. ② 교육정보원은 서비스용 설비의 용량에 여유가 없다고 판단되는 경우 이용자의 서비스 이용을 부분적으로 제한할 수 있습니다.
                  3. ③ 제 1 항 및 제 2 항의 경우에는 당해 사항을 사전에 온라인을 통해서 공지합니다.
                  4. ④ 교육정보원은 이용자가 게재 또는 등록하는 서비스내의 내용물이 다음 각호에 해당한다고 판단되는 경우에 이용자에게 사전 통지 없이 삭제할 수 있습니다.
                    1. 1. 다른 이용자 또는 제 3자를 비방하거나 중상모략으로 명예를 손상시키는 경우
                    2. 2. 공공질서 및 미풍양속에 위반되는 내용의 정보, 문장, 도형 등을 유포하는 경우
                    3. 3. 반국가적, 반사회적, 범죄적 행위와 결부된다고 판단되는 경우
                    4. 4. 다른 이용자 또는 제3자의 저작권 등 기타 권리를 침해하는 경우
                    5. 5. 게시 기간이 규정된 기간을 초과한 경우
                    6. 6. 이용자의 조작 미숙이나 광고목적으로 동일한 내용의 게시물을 10회 이상 반복하여 등록하였을 경우
                    7. 7. 기타 관계 법령에 위배된다고 판단되는 경우
                5. 제 13 조 (서비스 제공의 중지 및 제한)

                  1. ① 교육정보원은 다음 각 호에 해당하는 경우 서비스 제공을 중지할 수 있습니다.
                    1. 1. 서비스용 설비의 보수 또는 공사로 인한 부득이한 경우
                    2. 2. 전기통신사업법에 규정된 기간통신사업자가 전기통신 서비스를 중지했을 때
                  2. ② 교육정보원은 국가비상사태, 서비스 설비의 장애 또는 서비스 이용의 폭주 등으로 서비스 이용에 지장이 있는 때에는 서비스 제공을 중지하거나 제한할 수 있습니다.
                6. 제 14 조 (교육정보원의 의무)

                  1. ① 교육정보원은 교육정보원에 설치된 서비스용 설비를 지속적이고 안정적인 서비스 제공에 적합하도록 유지하여야 하며 서비스용 설비에 장애가 발생하거나 또는 그 설비가 못쓰게 된 경우 그 설비를 수리하거나 복구합니다.
                  2. ② 교육정보원은 서비스 내용의 변경 또는 추가사항이 있는 경우 그 사항을 온라인을 통해 서비스 화면에 공지합니다.
                7. 제 15 조 (개인정보보호)

                  1. ① 교육정보원은 공공기관의 개인정보보호에 관한 법률, 정보통신이용촉진등에 관한 법률 등 관계법령에 따라 이용신청시 제공받는 이용자의 개인정보 및 서비스 이용중 생성되는 개인정보를 보호하여야 합니다.
                  2. ② 교육정보원의 개인정보보호에 관한 관리책임자는 학술연구정보서비스 이용자 관리담당 부서장(학술정보본부)이며, 주소 및 연락처는 대구광역시 동구 동내로 64(동내동 1119) KERIS빌딩, 전화번호 054-714-0114번, 전자메일 privacy@keris.or.kr 입니다. 개인정보 관리책임자의 성명은 별도로 공지하거나 서비스 안내에 게시합니다.
                  3. ③ 교육정보원은 개인정보를 이용고객의 별도의 동의 없이 제3자에게 제공하지 않습니다. 다만, 다음 각 호의 경우는 이용고객의 별도 동의 없이 제3자에게 이용 고객의 개인정보를 제공할 수 있습니다.
                    1. 1. 수사상의 목적에 따른 수사기관의 서면 요구가 있는 경우에 수사협조의 목적으로 국가 수사 기관에 성명, 주소 등 신상정보를 제공하는 경우
                    2. 2. 신용정보의 이용 및 보호에 관한 법률, 전기통신관련법률 등 법률에 특별한 규정이 있는 경우
                    3. 3. 통계작성, 학술연구 또는 시장조사를 위하여 필요한 경우로서 특정 개인을 식별할 수 없는 형태로 제공하는 경우
                  4. ④ 이용자는 언제나 자신의 개인정보를 열람할 수 있으며, 스스로 오류를 수정할 수 있습니다. 열람 및 수정은 원칙적으로 이용신청과 동일한 방법으로 하며, 자세한 방법은 공지, 이용안내에 정한 바에 따릅니다.
                  5. ⑤ 이용자는 언제나 이용계약을 해지함으로써 개인정보의 수집 및 이용에 대한 동의, 목적 외 사용에 대한 별도 동의, 제3자 제공에 대한 별도 동의를 철회할 수 있습니다. 해지의 방법은 이 약관에서 별도로 규정한 바에 따릅니다.
                8. 제 16 조 (이용자의 의무)

                  1. ① 이용자는 서비스를 이용할 때 다음 각 호의 행위를 하지 않아야 합니다.
                    1. 1. 다른 이용자의 이용자번호를 부정하게 사용하는 행위
                    2. 2. 서비스를 이용하여 얻은 정보를 교육정보원의 사전승낙없이 이용자의 이용이외의 목적으로 복제하거나 이를 출판, 방송 등에 사용하거나 제3자에게 제공하는 행위
                    3. 3. 다른 이용자 또는 제3자를 비방하거나 중상모략으로 명예를 손상하는 행위
                    4. 4. 공공질서 및 미풍양속에 위배되는 내용의 정보, 문장, 도형 등을 타인에게 유포하는 행위
                    5. 5. 반국가적, 반사회적, 범죄적 행위와 결부된다고 판단되는 행위
                    6. 6. 다른 이용자 또는 제3자의 저작권등 기타 권리를 침해하는 행위
                    7. 7. 기타 관계 법령에 위배되는 행위
                  2. ② 이용자는 이 약관에서 규정하는 사항과 서비스 이용안내 또는 주의사항을 준수하여야 합니다.
                  3. ③ 이용자가 설치하는 단말기 등은 전기통신설비의 기술기준에 관한 규칙이 정하는 기준에 적합하여야 하며, 서비스에 장애를 주지 않아야 합니다.
                9. 제 17 조 (광고의 게재)

                  교육정보원은 서비스의 운용과 관련하여 서비스화면, 홈페이지, 전자우편 등에 광고 등을 게재할 수 있습니다.
              4. 제 4 장 서비스 이용 요금

                1. 제 18 조 (이용요금)

                  1. ① 서비스 이용료는 기본적으로 무료로 합니다. 단, 민간업체와의 협약에 의해 RISS를 통해 서비스 되는 콘텐츠의 경우 각 민간 업체의 요금 정책에 따라 유료로 서비스 합니다.
                  2. ② 그 외 교육정보원의 정책에 따라 이용 요금 정책이 변경될 경우에는 온라인으로 서비스 화면에 게시합니다.
              5. 제 5 장 마일리지 정책

                1. 제 19 조 (마일리지 정책의 변경)

                  1. ① RISS 마일리지는 2017년 1월부로 모두 소멸되었습니다.
                  2. ② 교육정보원은 마일리지 적립ㆍ사용ㆍ소멸 등 정책의 변경에 대해 온라인상에 공지해야하며, 최근에 온라인에 등재된 내용이 이전의 모든 규정과 조건보다 우선합니다.
              6. 제 6 장 저작권

                1. 제 20 조 (게재된 자료에 대한 권리)

                  서비스에 게재된 자료에 대한 권리는 다음 각 호와 같습니다.
                  1. ① 게시물에 대한 권리와 책임은 게시자에게 있으며, 교육정보원은 게시자의 동의 없이는 이를 영리적 목적으로 사용할 수 없습니다.
                  2. ② 게시자의 사전 동의가 없이는 이용자는 서비스를 이용하여 얻은 정보를 가공, 판매하는 행위 등 서비스에 게재된 자료를 상업적 목적으로 이용할 수 없습니다.
              7. 제 7 장 이의 신청 및 손해배상 청구 금지

                1. 제 21 조 (이의신청금지)

                  이용자는 교육정보원에서 제공하는 서비스 이용시 발생되는 어떠한 문제에 대해서도 무료 이용 기간 동안은 이의 신청 및 민원을 제기할 수 없습니다.
                2. 제 22 조 (손해배상청구금지)

                  이용자는 교육정보원에서 제공하는 서비스 이용시 발생되는 어떠한 문제에 대해서도 무료 이용 기간 동안은 교육정보원 및 관계 기관에 손해배상 청구를 할 수 없으며 교육정보원은 이에 대해 책임을 지지 아니합니다.
              8. 부칙

                이 약관은 2000년 6월 1일부터 시행합니다.
              9. 부칙(개정 2005. 5. 31)

                이 약관은 2005년 5월 31일부터 시행합니다.
              10. 부칙(개정 2010. 1. 1)

                이 약관은 2010년 1월 1일부터 시행합니다.
              11. 부칙(개정 2010. 4 1)

                이 약관은 2010년 4월 1일부터 시행합니다.
              12. 부칙(개정 2017. 1 1)

                이 약관은 2017년 1월 1일부터 시행합니다.

              학술연구정보서비스 개인정보처리방침

              Ver 8.6 (2023년 1월 31일 ~ )

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              (「전자상거래 등에서의 소비자보호에 관한
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              가. 파기절차
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                    작성 후 서면, 전자우편, 모사전송(FAX), 전화, 인터넷(홈페이지 고객센터) 제출
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              라. RISS는 정보주체 권리에 따른 열람의 요구, 정정·삭제의 요구, 처리정지의 요구 시
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              마. 정보주체의 권리행사 요구 거절 시 불복을 위한 이의제기 절차는 다음과 같습니다.
                   1) 해당 부서에서 열람 등 요구에 대한 연기 또는 거절 시 요구 받은 날로부터 10일 이내에 정당한 사유
                      및 이의제기 방법 등을 통지
                   2) 해당 부서에서 정보주체의 이의제기 신청 및 접수(서면, 유선, 이메일 등)하여 개인정보보호 담당자가
                      내용 확인
                   3) 개인정보관리책임자가 처리결과에 대한 최종 검토
                   4) 해당부서에서 정보주체에게 처리결과 통보
              *. [교육부 개인정보 보호지침 별지 제1호] 개인정보 (열람, 정정·삭제, 처리정지) 요구서
              *. [교육부 개인정보 보호지침 별지 제2호] 위임장
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              가. 내부관리계획의 수립 및 시행 : RISS의 내부관리계획 수립 및 시행은 한국교육학술정보원의 내부
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              나. 개인정보 취급 담당자의 최소화 및 교육
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                   - 한국교육학술정보원의 내부 관리 지침에 따른 교육 실시
              다. 개인정보에 대한 접근 제한
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                   개인정보에 대한 접근통제 실시
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              라. 접속기록의 보관 및 위변조 방지
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                   - 물리적 보관장소에 대한 출입통제, CCTV 설치․운영 절차를 수립, 운영
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