Glycogen synthase kinase 3 promotes the intermolecular association of tau = Glycogen synthase kinase 3의 타우단백질 상호결합 촉진에 관한 연구
저자
발행사항
춘천 : 강원대학교, 2008
학위논문사항
학위논문(박사)-- 강원대학교 일반대학원 : 의학과 2008. 8
발행연도
2008
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
강원특별자치도
기타서명
Glycogen synthase kinase 3의 타우단백질 상호결합 촉진에 관한 연구
형태사항
IV, 51 p.p. 26cm
일반주기명
지도교수:김성수
참고문헌 : p.
소장기관
The microtubule-associated protein tau is hyperphosphorylated and forms neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease (AD) brain, and there is increasing evidence that early fibrillar forms of tau are toxic to the cell. In addition to phosphorylation, tau in AD brain also undergoes limited proteolysis. Tau cleaved at Asp421 by caspase is present in AD brain and co-localizes with fibrillar tau pathologies. Additionally, caspase-cleaved tau more efficiently forms fibrillary structures in vitro and in situ. Glycogen synthase kinase 3β phosphorylates pathological epitopes of tau and induces the aggregation of caspase-cleaved tau in situ. Given the hypothesis that increased association of tau proteins precedes the formation of fibrillar structures, we generated a cell model to quantitate the extent of tau association in situ using fluorescence resonance energy transfer microscopy (FRET). The fluorophores cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) were attached to full-length (T4) and caspase-cleaved (T4C3) tau proteins at either the N- or C-terminals and a pair of CFP- and YFP- tagged tau constructs were transiently co-transfected in human embryonic kidney cells. The FRET efficiency was examined in the presence of a constitutively active (GSK3β-S9A) or a kinase-dead (kd) GSK3β. Expression of GSK3β-S9A significantly increased FRET efficiency compared to kd-GSK3β with both T4 and T4C3, indicating that GSK3β activation resulted in an increase in the self-association of both T4 and T4C3 tau. This is intriguing because only T4 is efficiently phosphorylated by GSK3β. Further, there was no significant difference in the FRET efficiency between T4 and T4C3 in the absence or presence of GSK3β, although only T4C3 in the presence of a GSK3β-S9A lead to the formation of Sarkosyl-insoluble inclusions. These FRET studies clearly demonstrate that GSK3β facilitates the association of T4 and T4C3 tau proteins, although only T4 is efficiently phosphorylated by GSK3β. However, T4C3 is necessary for the evolution of the tau oligomers into Sarkosyl insoluble inclusions even though it is not extensively phosphorylated, suggesting that extensive phosphorylation be not the necessary factor for the aggregate formation of tau. These data clearly suggest that increased association of tau should not be regarded as a direct indicator for the formation of insoluble tau aggregates.
더보기Neurofibrillary tangle (NFT)은 senile plaque과 더불어 알츠하이머병의 대표적인 병리학적 특징으로 비정상적으로 과인산화된 타우단백질로 구성되어 있으며, 이 타우 침착물, 특히 초기단계의 침착물이 신경세포 독성 발현에 중요한 역할을 나타내는 것이 보고되고 있다. 또한 타우 단백질은 caspases에 의해 분해되는 것이 관찰되었는데, 특히 Asp421 위치에서 절단된 타우 단백질이 알츠하이머병 환자의 뇌의 NFT에 존재하는 것이 관찰되었으며, 이 절단된 타우 단백질은 현저히 증가된 침착형성 활성을 나타내는 것이 보고되었다.
Glycogen synthase kinase 3β (GSK3β)는 침착형성에 기여하는 타우 단백질의 주요 부위를 인산화 시키며 caspase-3에 의해 절단된 타우 단백질의 침착형성을 촉진하는 것이 규명되었으며, 특히, 알츠하이머병 환자의 뇌에서 비정상적으로 활성이 증가된 것이 관찰되어 발병 요인으로써 GSK3β의 역할이 제시되고 있다.
타우단백질이 NFT 형성과정으로 진행되기 위해서는 타우단백질의 상호작용이 증가해야 하기에, 본 연구에서는 타우단백질의 상호작용을 정량적으로 관찰할 수 있는 최신의 연구방법인 fluorescence resonance energy transfer microscopy (FRET) 분석법을 세포 모델을 정립하고 GSK3β와 caspase-3 에 의한 절단이 타우단백질의 침착형성의 초기단계인 타우단백질 분자간 상호작용에 미치는 영향을 고찰하고자 하였다.
FRET 분석법을 확립하기 위하여 green fluorescent protein (GFP) 유도체인 cyan fluorescent protein (CFP)와 yellow fluorescent protein (YFP)을 각각 full-length (T4) 타우 및 caspase-3에 의해 절단된 타우 유전자 (T4C3)에 결합시켜 human embryonic kidney 세포에 도입한 후 GSK3β 활성화 유무에 따른 FRET efficiency를 관찰하였다. 활성화된 GSK3β에 의해 T4와 T4C3 모두에서 증가된 FRET efficiency가 관찰되었기에 GSK3β 활성이 타우단백질의 분자간 상호작용을 증가시키는 것이 규명되었다.
T4C3 타우 단백질은 T4 타우 단백질에 비하여 GSK3β에 의한 인산화 정도가 낮은 것을 고려할 때 caspase-3에 의해 절단되어 침착형성활성이 현저히 증가된 경우에는 소량의 인산화에 의해서도 침착형성으로 나아갈 수 있음을 제시한다. 또한 낮은 빈도로 인산화된 T4C3 타우 단백질은 최종 타우 침착형성을 나타낸 반면 과인산화된 T4 타우 단백질은 최종 타우침착물 형성을 나타내지 못하는 것이 관찰되었다.
결론적으로 본 연구는 GSK3β가 타우 단백질의 분자간의 초기 상호작용을 현저히 증가시키는 것을 규명하였으며, 증가된 분자간 타우단백질 상호작용이 최종 타우 침착물로 나아가기 위해서는 추가적인 세포내 요인이 필요한 것으로 판단된다. 따라서 초기 타우 분자간 증가된 결합이 최종 타우 침착물 형성의 지표로 오인하지 말아야 할 것을 제시한다.
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