A Dual Effect of Hydrocortisone on the Inhibition of intracellular Free Calcium Level Which are Highly Correlated with Leukotrien C₄ Production in Rat Basophilic Leukemia Cells : 세포내 칼슘량과 LEUKOTRIENE C₄ 생산은 不可無의 相關關係 = 호염기구 암세포내 증가된 칼슘량 억제에 있어서 부신피질 스테로이드 호르몬의 양면성 억제효과
저자
Her, Erk (Division of Immunology, Department of Medicine, College of Medicine, Kon-Kuk University)
발행기관
학술지명
권호사항
발행연도
1992
작성언어
English
주제어
KDC
511.000
자료형태
학술저널
수록면
49-65(17쪽)
제공처
人造 부신피질 호르몬중의 하나인 HYDROCORTISONE(HC)은 가장 강한 抗 Allergy 抗염증약이다. 이 약은 Allergy와 염증을 일으키는 물질들의 생산과 세포의 분비를 억제하는 것으로 알려져 있다.
Leukotriene(LTC4)는 이러한 Allergy와 염증을 일으키는 주요한 물질중의 하나이다. LTC4는 5-lipoxygenase(5-LOX)라는 효소에 의해 세포막 지질에서 생성된 Arachdonic acid라는 지방산으로부터 생산된다. 이 효소의 촉매작용은 칼슘의 농도에 크게 의존한다. 이러한 학문 바탕 위에서, 호중구 암세포(RBL-2H3)에 있어 항원에 의해 유기된 LTC4 생산을 HC가 어떠한 mechanism속에서 억제하는지 알고자 함이 실험연구의 목적이다.
기본실험에 있어, LTC4 생산을 의한 DNP10BSA 항체 IgE와 항원 DNP10BSA의 최고 효과적인 농도는 각각 2㎍/106 cells, 18.8ng/106 cells이었다. HC가 항원이 유기 생산한 LTC4량을 억제하는 것은 배양시간과 농도에 의존했었다. 최고 효과적인 항원 농도에 의해 유기 생산된 LTC4량을 50% 억제하는데 최고 효과적인 HC농도(1㎍/ml)로 2.5 시간의 사전 배양이 요구되었다. HC 사전 배양시간이 증가함에 따라 항원에 유기생산된 LTC4량이 감소하는데, 4시간 사전 배양은 control에 비해 75%을 감소시켰다(p < 0.005). 4시간 HC 사전 배양후, LTC4 생산을 억제하는데 HC의 IC50價는 0.3μM이였고, 최대 억제농도는 27μM였다.
LTC4량을 측정하는데 Radioimmunoassay(RIA)법의 신뢰 여부를 알기 위해, 다른 방법중의 하나인 Thin layer chromatography(TLC)법을 이용하여 비교해 봤다. 비교 결과, RIA법의 신뢰도가 높았고, 上同 2개의 방법에 의한 값이 거의 相同했었으며, RBL-2H3 암세포는 LTC4를 거의 생산치 않고 주로 LTC4를 생산한다는 것이 발견되었다(LTC4 vs LTD4 p<0.005).
세포내 방사선 동위원소 칼슘(45Ca2+)의 침투량을 측정하는 실험에 있어서는 세포내의 칼슘의 이온화와 불이 온화를 구별할 수 없는 단점이 있어 이온화된 칼슘만을 측정할 수 있는 방법을 모색했었다. 세포내 이온화된 칼슘 측정이 중요한 것은 세포학에서 말하는 주요한 second messenger가 이온화된 칼슘이기 때문이다. 그래서 이온화된 칼슘의 양의 증감을 측정하기 위해 Quin2/AM법을 사용했다. 항 DNP10 BSA 항체 IgE가 감작된 RBL-2H3 암세포에 항원 DNP10BSA로 유기했을 때 세포내 이온화된 칼슘([Ca2+]i,)의 양이 비교구보다 3.5배나 증가했었다(p<0.01).
항원 DNP10 BSA로 RBL-2H3를 유기했을 때 [Ca2+]i량이 최고치에 도달하는 데 소요되는 시간은 1.5∼2분 정도였다. 그런데 HC가 사전 처리한 세포에서는 [Ca2+]i, 최고치가 현저히 억제되었다(p<0.01). 항원을 투입한 뒤 12분후, HC를 사전 처리하지 않는 세포에 있어서는 최고치량에서 7 ± 3% 정도 감소했었다. 이에 반해 HC를 사전 처리한 세포에서는 75 ± 7% 감소했었다(p<0.005).
HC를 6시간 사전 처리한 세포들은 현저히 LTC4 생산뿐만 아니라 [Ca2+], 증가를 현저히 감소시켰다(p<0.05). 이러한 HC 효라는 세포내 칼슘 침투를 억제하는 藥 Nifedipine과 세포내 칼슘을 세포외로 pumping하는 藥 TPA의 효과와 흡사했다. 그래서 HC는 세포내 칼슘량을 억제하는 데 양면성이 보인다고 예측되어진다. 그리고 [Ca2+]i량의 증감과 LTC4 생산 증감과 밀접한 상관관계가 있다는 것이 통계적으로 입증되었다(r = 0.94, p<0.01).
결론적으로 호염기구에서 HC이 LTC4를 억제하는 mechanism은 일차적으로 미지의 단백질을 생산하고 이러한 단백질이 세포내 칼슘의 침투를 억제하거나 세포내 칼슘을 세포외로 pumping함으로써 [Ca2+]i량을 억제하는 것 같다.
Hydrocortisone(HC) is extremely potent anti-allergic and antiinflammalory druge which suppress the biosynthesis and/or release of inflammatory mediators. Leukotriene C4 (LTC4) is one of the maim mediators, which is produced through the 5-lipoxygenase. This enzyme activity is dependent on high Ca2+ concentrations. The aim of this study was to insight the mechanism of HC actions on antigen-induced LTC4 formation in rat basophilic leukemia(RBL-2H3) cells.
The maximal effective doses IgE and its antigen DNP10BSA for stimulation of the LTC4 formation were 2㎍.106 cells and 18.8ng/106 cells, respectively, The inhibitory effect of HC on the antigen-induced LTC4 formation was time-and dele-dependent. The half maximal effective time for the HC action was about 2.5 hr(hours) of preincubation. This time-dependent inhibition increased slowly to approximately 75% inhibition(p < 0.005) after 4 hr of pretreatment. Under 4 hr pretreatment with HC, IC50 values of HC on LTC4 production was 0.3μM, and maximal inhibitory dose was 2μM.
In validation of the radiommunoassay(RIA) for the measurement of LTC4 production using a thin layer chromatography(TLC), I found that RBL-2H3 produced mainly LTC4, while only slightly LTD4 (LTC4 vs LTD4 p,0.005). The results obtained with TLC with regard to LTC4 formation were similar to that obtained by RIA.
Since radioisotope labelled calcium(45Ca2+) studios have limited resolution to distinguish intracellular free calcium([Ca2+]i) from the whole cellular Ca2+, 1 measured [Ca2+]i, using a Quin2/AM probe. In the cells stimulated by maximal effective dose of antigen, HC markedly suppressed [Ca2+]i elevation (p 01). Half maximal time for elevation of [Ca2+]i induced by antigen was less than 1 min, and maximal elevation of [Ca2+]i (3 fold increase) was reached within 1.5∼2 minutes(min). This peak of [Ca2+]i level in the control group decreased gradually to 7 ± 3% during 12 min of incubation. Following pretreatment with HC, the antigen-stimulated increase of [Ca2+], was stunted by 41 ± 8%(p<0.01) after 2∼3 min and drastically reduced by 75 ± 7%(p<0.005) at 12 min.
Preincubation for 6 hr of RBL-2H3 cells with HC(1㎍/ml) abolished the anti DNP10BSA antibody IgE and antigen DNP10BSA complex(Ag-Ab) induced [Ca2+]i increment and LTC4 production(p <0.05).
This HC effect on two parameters mimicked the direct effects of Ca2+ efflux enhancer, TPA, and a Ca2+ channel blocks, nifedipine. Moreover, there was high correlation between [Ca2+]i elevation and LTC4 formation(4 = 0.94, p < 0.01), suggesting a causal relation between the two parameters. These data indicate that the inhibitory effect of HC on LTC4 formation requires a DNA-dependent protein synthesis and reduction of [Ca2+]i.
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