방선균 유전자의 대장균에서의 이종발현에 관한 연구 = Study on Heterologous expression of streptomyces genes in E.coli
메타게놈 숙주인 대장균에서 다른 세균으로부터 유래한 유전자들의 발현 장벽은 기능을 토대로 한 메타게놈학의 발전을 저해하는 가장 큰 문제점 중에 하나이다. G+C 함량이 높은 그람 양성 세균 (High G+C Gram positive bacteria)은 거의 모든 환경에 풍부하게 존재하고, 다양한 생리 활성 물질을 생산하기 때문에 신물질 발굴에 중요한 세균으로 인식됨에도 불구하고, 이들 유전자의 약 70% 정도는 대장균의 전사 단계, 적어도 대장균 주 시그마 인자 (major sigma factor)에 의해 발현되지 않는다고 알려져 있다. 본 연구에서는 G+C 함량이 높은 그람 양성 세균의 모델 유전자로서, 방선균 chiA (Chitinase, SCO5003), chiC (chitinase AAF43629), pro7432 (protease, SCO7432), degP (agarase, NP627674) 유전자의 발현을 대장균에서 각각 전사와 번역 수준에서 분석하였다. 플라스미드 유래의 프로모터의 영향을 최소화하기 위하여 클로닝 자리 양쪽에 전사 종결 신호(transcription terminator)가 삽입된 pUC21을 제조 하고, 각각의 모델 유전자를 이 플라스미드에 클로닝 하였다. 모든 모델 유전자들은 대장균에서 웨스턴 블로팅 상에서 발현이 검출되지 않았다. 하지만, 방선균의 주 시그마 인자인 hrdB와 보조 시그마 인자인 hrdD, sigE를 모델 유전자와 함께 발현시킨 결과, sigE를 동시에 발현시킨 경우, degP 유전자의 발현이 확인되었다. 이 결과로 보아, 대장균에서의 방선균 유전자의 발현 장벽의 한 부분은 대장균에는 방선균의 프로모터 서열을 인식하는 시그마 인자의 결핍에 의한 것으로 추정 된다.
더보기Expression barrier of foreign genes in metagenomic host is one of the most challenging obstacles to advance toward function-driven metagenomics. Although high G+C Gram positive bacteria are popularly included in environmental samples due to their ubiquity in virtually all environments and have been given considerable attention as producers of a variety of biological active compounds, about 70 % of their genes, it was predicted, is not transcribed by Escherichia coli transcription machinery, at least major sigma factor. We analyzed expression of the chiA gene coding for chitinase (SCO5003), the pro7432 gene for protease (SCO7432), the degP gene for agarase (NP627674) from Streptomyces coelicolor and the chiC gene for chitinase (AAF43629) from S. peucetius, as model genes of high G+C Gram positive bacteria, in E. coli with respect to transcription and translation levels. To minimize transcription of the model genes from plasmid-born promoters, the models genes were cloned into pUC21 in which two transcription terminator units were inserted on either side of multiple cloning sites. None of the model genes were expressed in E. coli enough to be detected by Western blotting. When the gene encoding major sigma factor, HrdB and genes encoding minor sigma factors, HrdD and SigE of Streptomyces coelicolor were co-expressed with the models genes, sigE induced expression of the degP gene which suggests that a part of expression barrier of streptomyces genes in E. coli results from lack of the sigma factor to recognize the promoter sequence.
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