파골세포 분화시 TGF-β에 의한 새로운 신호전달계 유발기작 = (The)alternative pathway of TNF-mediated osteoclast differentiation by TGF-β
Osteoclasts are multinucleated gigantic cells responsible for bone resorption, and are derived from hematopoietic precursors. It is well known that two factors supplied by stromal cells or osteoblasts are essential for the differentiation and the maturation of osteoclast precursors in the physiologically condition, such as M-CSF and RANKL, also called as TRANCE, ODF and OPGL. In the presence of both M-CSF and RANKL, osteoclast precursors from mouse bone marrow cells, spleen cells, or human peripheral blood differentiate to mature osteoclasts without supporting cells, such as stromal cells or osteoblasts. Because of the bone phenotype of RANKL or TRAF6 deficient mice, which showed osteopetrosis, RANKL/TRAF6 signaling has been thought essential for osteoclast differentiation.
To elucidate possible pathway of osteoclast differentiation mediated by TNF family members such as TNF-α and RANKL, the author analyzed osteoclastogenesis using TRAF6 or RANKL knockout mice using molecular and biological tools.
Here this study showed evidence of induction of mature osteoclasts even in the absence of RANKL or TRAF6. TGF-β, a co-stimulatory factor, is required for the formation of mature osteoclasts from osteoclast precursors mediated by M-CSF and RANKL When these precursors were further incubated with M-CSF and RANKL, surprisingly, TRAP(+) MNCs were found in M-CSF and TGF-β-pretreated precursors from the TRAF6 KO, but not in M-CSF-pretreated precursors. The expression of TRAP and OSCAR, authentic markers specific for mature osteoclasts, was strongly induced by RANKL in M-CSF and TGF-β-treated cells from TRAF6 KO mice. However, TRAP(+) MNCs from M-CSF and TGF-β-treated cells of TRAF6 KO mice failed to form actin rings or to resorb bone. These results indicate that TGF-β can support RANKL-mediated osteoclast development in the absence of TRAF6 up to the stage where TRAP(+) MNCs develop; however, TRAF6 appears to be necessary for the mature function of osteoclasts.
Since TRAP(+) MNCs from hematopoietic precursors could be generated in the absence of TRAF6, I checked the role of TGF-β in TNF-α-induced osteoclastogenesis. Since TGF-β could support osteoclast differentiation even in the absence of TRAF6, and the TNF-α signaling cascade does not require TRAF6, I tested whether TGF-β treatment could support osteoclastogenesis mediated by TNF-α in WT, RANKL KO, or TRAF6 KO mice. TRAP(+) MNCs differentiated by TNF-α from M-CSF and TGF-β-pretreated precursors of WT and TRAF6 KO mice successfully formed F-actin rings. These results indicate that TNF-α alone could support osteoclast formation in the absence of RANKL and TRAF6, but that this differentiation depends on pretreatment with TGF-β. Pretreatment of TGF-β enhanced phosphorylation of p38 and induction of NFATc1 mediated by TNF-α. These results thus indicate that the activation of p38 and induction of NFATc1 is a possible mechanism whereby TGF-β pretreatment potentiates TNF-α-mediated osteoclast formation. TGF-β might play a key role for osteoclast differentiation not only in physiological but also pathological conditions.
Hematopoietic 전구체로부터 분화되는 파골세포는 골흡수를 담당하는 세포이다. 파골세포는 골합성을 담당하는 조골세포와 함께 골대사를 조절하는 중요한 세포중의 하나이며 이들 사이의 균형적인 작용은 골대사에 있어서 매우 중요하다. 파골세포의 분화는 osteotropic 인자들에 의해 유도되는데, 최근에 이러한 인자들이 조골세포 및 간질세포에 작용하여 파골세포의 분화 시 필수 불가결 물질인 M-CSF와 RANKL의 발현을 촉진함이 밝혀졌다. 또한 이들에 의해 파골세포 분화시에 전달되는 신호전달계에 대한 연구가 활발히 진행되어 오고 있다. 본 연구는 TNF 계열의 일원들에 의한 파골세포의 분화 시에 전달되는 신호전달계에 대한 연구로서 기존의 밝혀진 경로가 아닌 또 다른 경로로의 신호전달이 가능성에 대해 고찰하여 보았다.
본 실험에 이용된 방법들은 주로 분자 세포생물학적인 것으로서 TRAP 염색법을 통한 다핵 파골세포의 관찰, PCR을 이용한 유전자 발현양 조사 및 western 분석을 통한 단백질 양의 변화 등을 조사하였다.
몸 속에 다량으로 존재하는 cytokine 중의 하나인 TGF-β는 골수세포로부터 M-CSF와 RANKL에 의해 유도되는 파골세포로의 분화 시 필수적이며 분화 시에 co-stimulatory factor로서 작용함을 알 수 있었다. TRAF6는 RANKL의 신호전달시 중요한 물질로 알려져 있는데, TRAF6 knockout 생쥐 (in vivo)에서는 TRAP(+) 다핵파골세포를 형성할 수 있었으나, TRAF6 knockout 생쥐에서 얻은 비장세포 (in vitro)로부터 RANKL에 의한 파골세포 분화는 일어나질 않았다. 이러한 상반된 결과의 원인을 분석하기 위해 본 연구에서는 연령에 따라 증가하는 물질 중의 하나인 TGF-β에 대한 파골세포 분화에 있어서의 역할을 조사하였다. M-CSF만을 전처리한 TRAF6-deficient 비장세포에서는 RANKL의 처리로 파골세포로의 분화가 일어나질 않았으나, M-CSF와 TGF-β로 파골세포 분화의 초기단계에 전처리한 결과 TRAF6가 없는 조건에서도 RANKL에 의한 분화가 촉진되었다. 이러한 TRAF6 knockout 생쥐에서 유도된 TRAP(+) 다핵파골세포는 파골세포의 marker 유전자인 OSCAR나 TRAP 유전자가 발현하고 있었으나 F-actin 고리나 dentine 절편에서의 pit을 형성하지 못하였는데, 이러한 결과는 TRAF6가 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화에 있어서는 필수적이 아니지만 성숙한 파골세포의 활성화에 있어서는 절대적임을 제시하고 있다. 아울러 TGF-β는 RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 분화 시에 중요한 역할을 하며, RANKL의 신호전달이 TRAF6가 없는 상황에서 다른 신호전달 물질의 이용을 가능케 하는 alternative pathway를 거쳐서 파골세포의 분화가 일어날 수 있도록 도와줌을 알 수 있었다.
TNF 계열의 또 다른 일원인 TNF-α는 RANKL의 경우와는 달리 TRAF6를 거치지 않고 신호를 전달하는 것으로 알려진 바 있기에, TNF-α가 파골세포의 분화를 단독적으로 유도할 수 있는지를 RANKL 또는 TRAF6 knockout 생쥐를 이용하여 조사하였다. 그 결과 TNF-α 자체는 RANKL의 도움이 없이도 파골세포의 분화를 유도할 수 있으나 TGF-β의 전처리가 필수적임을 알 수 있었다. 이렇게 만들어진 성숙한 파골세포는 F-actin 고리를 형성하는 것으로 보아 TNF-α가 TGF-β의 도움으로 파골세포의 분화를 촉진하는 것뿐만이 아니라 활성화를 촉진할 수 있음을 보여주었다. 아울러 TGF-β의 전처리는 파골세포의 분화 시 중요한 것으로 알려진 p38의 활성화와 NFATc1 유전자의 발현을 증가시켜 줌으로써 TNF-α에 의한 신호전달시 파골세포의 분화를 가능케 함을 보여주었다.
이상의 결과들로부터 본 연구에서는 TRAF6가 파골세포의 분화에 꼭 필요한물질은 아니나 파골세포의 활성화에는 필수 불가결임을 알 수 있었다. TRAF6를 거치지 않는 제3의 신호전달 경로는 연령에 따라 몸속에 존재하는 양이 증가하는 TGF-β에 의해 촉진될 수 있음을 또한 입증하였다. TGF-β는 파골세포 분화에 필수적이며 TRAF6가 없는 조건에서도 RANKL 뿐만이 아니라, TNF 계열의 또 다른 일원인 TNF-α에 의한 신호전달을 가능케 할 수 있음을 알 수 있었다.
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