Itch 활성 조절에서 MST1의 역할 연구 = Role of MST1 in the regulation of Itch activity

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The hippo pathway signaling controls organ size via regulating cell proliferation and apoptosis. Mammalian Sterile 20-like kinase 1/2 (MST1/2) are serine/threonine kinase and core component of Hippo pathway. In high cell density, active MST1/2 phosphorylate Large Tumor Suppressor Kinase 1 (LATS1) and then activate LATS1. LATS1 phosphorylate Yes Associated Protein 1 (YAP1) and phosphorylated YAP1 remains in cytoplasm, which leads to inhibition of expression of genes responsible for cell proliferation and anti-apoptosis. ITCH is a HECT type E3 ubiquitin ligase that transfers ubiquitin to target substrates. ITCH ubiquitinates LATS1 and induces proteasomal degradation. Here we found that MST1 inhibits auto-ubiquitination and activity of ITCH E3 ligase while MST1 Kinase Dead and MST2 couldn’t inhibit auto-ubiquitination of ITCH. It shows that MST1, not MST2 regulates E3 ligase activity of ITCH. Ubiquitination of LATS1, which may be linked to the proteasomal degradation, is decreased due to inactivation of ITCH by MST1. Overall our data suggested that MST1 can reduce auto-ubiquitination of ITCH and inhibits activity of ITCH which leads to stabilization of LATS1 and enhances activation of Hippo pathway signaling.

국문 초록 (Abstract)

Hippo 신호전달은 세포의 증식과 사멸을 조절하여 기관의 크기를 조절한다고 알려져 있다. Mammalian Sterile 20-like kinase 1/2 (MST1/2)는 세린/트레오닌 인산화 효소로 Hippo 신호전달의 주요 인자이다. 세포고밀도 상태일 때 활성화된 MST1/2는 인산화 효소 Large Tumor Suppressor Kinase 1 (LATS1)을 인산화 시켜 활성화 되게 한다. LATS1은 전사 활성을 돕는 Yes Associated Protein 1 (YAP1)을 인산화 시키는 것으로 알려져 있으며 인산화 된 YAP1이 세포질에 존재하게 되면서 세포증식과 세포사멸에 관련된 표적 유전자의 발현이 억제된다. ITCH는 E3 유비퀴틴 결합 효소로 표적 단백질에 유비퀴틴은 전달하는 역할을 한다. ITCH는 인산화 효소인 LATS1을 유비퀴틴화 시켜 단백질분해효소복합체에 의해 분해되도록 유도한다. 본 실험에서 MST1이 ITCH의 자기유도 유비퀴틴화를 억제 시키며 그에 따라 ITCH의 활성을 억제 시키는 것을 보았다. 하지만 MST1 인산화 돌연변이와 MST2는 ITCH의 자기유도 유비퀴틴화를 감소시키지 못하는 것을 관찰하였다. 이것으로 보아 MST2가 아닌 MST1이 ITCH의 활성을 조절하는 것으로 보인다. 그 결과 MST1에 의한 ITCH의 불활성화 때문에 단백질 분해효소 복합체에 의해 분해되는 것과 연관된 LATS1의 유비퀴틴화가 감소되었다. 따라서 결과적으로 MST1은 ITCH가 자기유도 유비퀴틴화 되는 것을 억제 해 활성을 감소시키고 나아가 ITCH의 표적단백질인 LATS1을 안정화시키면서 Hippo 신호전달 활성을 강화시키는 것으로 보인다.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 2. MATERIAL AND METHODS 3
• 2.1 Plasmids, siRNAs 3
• 2.2 Cell culture and Transfection 3
• 2.3 Immunoprecipitation and Immunoblotting and antibodies 4
• 2.4 In vivo Ubiquitination assay 5
• 2.5 Preparation of recombinant proteins and in vitro kinase assay 6
• 3. RESULTS 7
• 3.1 MST1 regulates ITCH in YOD1 independent manner. 7
• 3.2 MST1 regulates ITCH level, but MST1 does not bind to ITCH. 8
• 3.3 MST1 does not phosphorylate ITCH. 8
• 3.4 MST1 dose dependently reduces ubiquitination of ITCH and LATS1. 9
• 4. DISCUSSION 18
• 5. REFERENCES 20
• 국문초록 23
• 감사의 글 25