식물 추출물과 사람 케모카인 CCL23 가 포유동물 세포에 미치는 염증 반응과 증식 효과

국문 초록 (Abstract)

천연소재로부터 항 알러지, 항암작용, 항 염증 등 약물학적 특성에 대해 많은 연구가 이루어지고 있다. 이러한 식물들로부터의 항 염증활성은 염증에 있어 조절인자 중 산화질소 (NO) 를 생성하는 iNOS를 억제함으로써 작용한다고 보고 되고 있다. 본 연구진은 새로운 항 염증을 갖는 천연소재를 찾기 위하여 윤판나물 추출물을 이용해 LPS에 유도된 마우스 RAW 264.7 대식세포에서 염증 반응 기전에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 본 연구에서는 LPS로 염증 반응이 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 윤판나물 추출물이 산화질소 생산량을 저해하는 효능을 측정하였다. 본 연구 결과에 따르면, 윤판나물 추출물은 100 g/ml 농도까지 산화질소 생성을 농도의존적으로 저해하였으며 세포 독성은 전혀 나타나지 않았다. 윤판나물 (Disporum sessile D.Don) 추출물은 대표적인 염증 반응 매개자인 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 및 단백질 발현 양을 현저하게 감소시켰다. 또한 초기 염증 반응에 관여한다고 알려진 여러 사이토카인의 mRNA양을 측정하였을 때도 마찬가지로 농도 의존적으로 저해하는 활성을 보였다. 윤판나물 추출물은 LPS에 의해 유도된 RAW 264.7 세포에서 염증 반응을 조절하는 주요한 인자인 NF-κB의 발현을 저해할 뿐만 아니라 NF-κB의 활성을 감소시키는 효과를 나타냈다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 윤판나물 추출물은 아마도 염증에 관련된 질병을 예방할 수 있는 천연소재로 개발될 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In an attempt to find new anti-inflammatory agents from natural products, this study examined whether the crude methanol extract of Disporum sessile D.Don has a suppressive effect on inducible enzymes and pro-inflammatory cytokines by inhibiting the NF-κB pathway in LPS-stimulated macrophage RAW 264.7 cells. The cells were pretreated with the indicated concentrations of Disporum sessile D.Don extract (12.5, 25, 50, and 100 ㎍/㎖) and then treated with LPS (1 ㎍/㎖). The results showed that Disporum sessile D.Don extract inhibited the LPS-induced mRNA and protein expression of iNOS in macrophage RAW 264.7 cells. In addition, the expression of COX-2 was significantly inhibited at the mRNA and protein levels by Disporum sessile D.Don extract. The mRNA expression of pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α and IL-6, were markedly reduced by Disporum sessile D.Don extract. Moreover, Disporum sessile D.Don extract suppressed the nuclear translocation of the NF-κB subunits, which was correlated with its inhibitory effect on I-κB phosphorylation. These results suggest that Disporum sessile D.Don has anti-inflammatory properties by modulating the expression of iNOS, COX-2, and pro-inflammatory cytokines in macrophage RAW 264.7 cells via the NF-κB pathway.The present results show that the extract of Disporum sessile D.Don exerting strong anti-inflammatory activity which may prove beneficial with regard to the development of a therapeutic agent for prevention and treatment of inflammatory diseases.

국문 초록 (Abstract)

최근 연구 결과에 의하면 인간 케모카인 중 하나인 CCL23 (MPIF-1, MIP3, CKβ8) 는 인간 혈관 내피세포의 이동, tube 형성 그리고 matrix metalloproteinases (MMPs) 에 의해서 혈관 신생을 증진시킨다고 알려져 있다. 이전에 수행 했었던 microarray 분석에 의하면, CCL23 에 의하여 다양한 종류의 유전자들의 전사가 조절됨을 알 수 있었다. 특히 그 중에서도 세포의 성장과 유지에 관련된 유전자가 조절 되었고, 이를 통해서 세포의 성장과 관련된 단백질의 수용체 단백질들도 증가 될 것이라는 것을 예상할 수 있었다. 그 중에서도 CCL23 의 농도가 증가할수록 (0.1 ~ 10 ng/㎖) 표피생장인자 수용체 (Epidermal growth factor receptor, EGFR) 의 발현이 증가한다는 결과를 기존 연구를 통해 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 인간 혈관 내피 세포에 CCL23 를 처리하여 EGFR 의 발현을 증가시킨 뒤 표피 생장 인자 (EGF) 를 처리하여 세포 내에서 일어나는 세포의 생장 및 생존 기작에 대해 연구를 수행하였다. 인간 혈관 내피 세포에서 CCL23 만 단독으로 처리하였을 때 비처리 군에 비하여 생장에 미치는 효과가 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 반면에 EGF 가 처리된 그룹에서는 세포의 대사 활성 및 세포수가 크게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 CCL23 를 처리함으로써 농도의존적으로 EGF 에 의한 세포 생장이 저해되는 효과를 나타냈다. 이러한 효과는 인간 혈과 내피 세포에서 세포 사멸 (apoptosis) 가 유도되어 일어나는 현상이 아닌, p21 과 p27 유전자의 발현이 유도됨으로 인하여 G1 기에서 S 기로 진행하는 cell cycle 을 arrest 시킴으로써 일어나는 반응이라 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

It has been recently reported that human CCL23 (also known as MPIF1, MIP3, or CK8) promotes endothelial cell migration and tube formation, while it has no effect on proliferation of endothelial cells. In previous study, we conducted DNA microarray analysis to determine gene expression alterations in response to the treatment of HUVECs with CCL23 using 22,000 human genes microarray. We found that the CCL23 dependent modulation in the expression of genes represented a wide variety of functional categories including genes important in the cell growth and maintenance. Based on the micro array analysis data, we focused on up-regulation of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) by CCL23. EGF stimulated proliferation of HUVECs, which was significantly inhibited by pretreatment of CCL23 In dose-dependent manner. EGF-stimulated phosphorylation of ERK was reduced in CCL23-treated cells, while phosphorylation of STAT1 was increased by CCL23, indicating that STAT1 is involved in the inhibition of EGF-induced proliferation of endothelial cells by CCL23.

목차 (Table of Contents)

• 목차 ...........................................................................ⅰ
• PART Ⅰ. 윤판나물 (Disporum sessile D.Don) 추출물에 의한 Lipopolysaccharide 로 유도된 RAW 264.7 세포에서 염증 억제 효과
• 표와 그림 차례 ............................................................ⅲ
• 국문 초록 ...................................................................ⅴ
• 서론 ........................................................................... 2
• 실험 재료 및 방법 ......................................................... 4
• 결과 ........................................................................... 8
• 1. 윤판나물 추출물이 산화 질소에 미치는 영향 .................. 8
• 2. 윤판나물 추출물에 의한 iNOS 유전자 발현 억제 ............. 8
• 3. 윤판나물 추출물에 의한 COX-2 유전자 발현 억제 ........... 9
• 4. 염증성 사이토카인발현에 대한 윤판나물 추출물의효과 .... 9
• 5. IκB-α 의 phosphorylation 과 degradation 에 대한 윤판나
• 물 추출물의 효과 ..................................................... 10
• 6. 윤판나물 추출물에 의한 p65 단백질의 핵 내로의 이동 억
• 제 ........................................................................ 10
• 7. NF-κB 활성에 대한 윤판나물 추출물의 효과 ................ 11
• 고찰 ......................................................................... 12
• 표와 그림 .................................................................. 14
• 표와 그림 범례 ........................................................... 23
• 참고문헌 ................................................................... 26
• 영문초록 ................................................................... 30
• PART Ⅱ. 인간 내피 세포에서 CCL23 에 의한 표피 생장 인자 수용체 발현 증가와 표피 생장 인자에 의해 유도되는 세포증식 저해 효과
• 국문 초록 ................................................................... 32
• 서론 .......................................................................... 33
• 실험 재료 및 방법 ........................................................ 36
• 결과 .......................................................................... 39
• 1.인간 혈관 내피 세포에서 CCL23 와 EGF 가 세포 대사 활성
• 에미치는 영향 .......................................................... 39
• 2. 인간 혈관 내피 세포에서 EGFR 의 하위 신호 전달 경로에
• 서 STAT1 의 인산화 증가 .......................................... 39
• 3. 인간 내피 세포에서 CCL23 와 EGF 가 세포 사멸에 미치는
• 영향 ....................................................................... 40
• 4. 인간 내피 세포에서 CCL23 와 EGF 가 세포 성장에 미치는
• 영향 ....................................................................... 41
• 고찰 .......................................................................... 43
• 그림 .......................................................................... 45
• 그림 범례 ................................................................... 55
• 참고문헌 .................................................................... 57
• 영문초록 .................................................................... 61