백신위해성평가사업(Ⅱ) : 생물의약품의 안전성 평가를 위한 A형 간염 바이러스(HAV)의 오염지표 수립에 관한 연구 = Establishment of HAV Contamination Index for Viral Clearance Validation in Biological products
저자
김병국 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 백선영 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 신진호 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 김재옥 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 민경일 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 류승렬 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 민복순 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 김도근 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 박미경 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 안미진 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 이상건 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 이석호 (식품의약품안전청 생물의약품평가부) ; 박순희 (식품의약품안전청 생물의약품평가부)
발행기관
학술지명
식품의약품안전청 연보(The Annual report of Korea food & drug administration)
권호사항
발행연도
2001
작성언어
Korean
주제어
자료형태
학술저널
수록면
366-379(14쪽)
소장기관
생물의약품의 안전성을 확보하기 위하여 제조공정 증 바이러스 등의 위해 물질 제거 및 불활즉 공정과정의 확립이 필수적이며 이에 대한 평가를 위하여 감도와 특이도가 높은 오염물질의 검출 방법 확립이 매우 중요하다. 본 연구에서는 모델 바이러스로 A형간염바이러스fhepautis A virus :HAV)를 대상으로 real-tile PCR을 이용하여 실시간으로 정확하고 민감하게 바이러스를 검색하고 정량할 수 있는 시험법을 개발하였고 이로부터 바이러스의 오염지표를 수릴할 수 있는 기반을 마련하였다. 먼저 LightC?cBerT.4i(Roche)를 이용하여 바이러스를 검색하기 위한 real-time PCR의 최적 조건을 확림하였다. HAV의 겅색과 정량을 위한 표준 RNA는 flasmid PHAV/7으로부터 in uitro transcription을 수행하여 만들었다. 정제된 RNA를 Ix10'copies/#』부터 Ix10"copies/낄까지 계단 희석하여 표준바이러스로 사용하였다. Real-time PCR로 표즌 RNA의 유효성과 재현성을 검사한 결과 각 희석 단계 모두 표준편차가 0.3을 넘지 않았고 변이계수는 0.02를 넘지 않아 표준 RNA는 우수한 유효성과 재현성을 보여 주었다. 세포배양으로부터 녈리한 HAV를 표준 RNA를 이용하여 정량하고 혈액제제에 spiking실험을 수행하였다. 이 패 제젠로 인한 PCR반응의 간섭이 나타났으며 이것은 표준 aHA를 오염되지 않은 같은 제제로_희석하여 끊색과 정량에 사용함으로서 오차를 줄일 수 있었다. 이 실험에서 개발된 Lightcycler를 이용한 real-time PCR법에 의해 HAV는 Ix102 copies/re이하까지 검색이 가능하였다. 또한 제제에 바이러스를 spiking 한 경우에도 같은 민감도를 보였다. Real-time 정량 PCR방법은 표준 RNA를 이용하여 생물학적제제에서 바이러스의 검색과 정량에 매우 유용하게 이응할 수 있다.
더보기The establishment of the highly specific and sensitive detection and clearance method of contaminants such as virus in the manufacturing process is essential and important for the safety of biological products. In this study, the sensitive real-time detection and quantification method of Hepatitis A virus as a model virus using LightCycerTM(Roche, Germany) was established for the viral clearance validation and contamination index. First, the optimization of real-time PCR condition such as annealing temperature and magnesium ion concentration was performed. The standard RNA(sRNA) used as quantification standard was prepared from plasmid pHAV/7 by in vitro transcription and was serially 10-fold diluted from 1×107 to 1×102copies/㎕. The standard deviation and coefficient variation of sRNA was not more than 0.3 and 0.02 respectively. It showed pretty good efficacy and reproducibility. The purified RNA from cell culture was quantified using sRNA and spiked into blood products. To reduce the interference of product itself in PCR reaction, sRNA was diluted with uncontaminated product. The sensitivity of the assay was 1×102 copies and the similar results was obtained in spiked blood products. From the study, real-time quantitative PCR method can be used to detect and quantify viral contaminants with a standard RNA in biological products.
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