Pseudomonas syringae pv. phaseolicola로부터 제한효소의 분리정제 및 특성 = Purification and Characterization of a Restriction Endonuclease from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

국문 초록 (Abstract)

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola로 부터 새로운 제한효소 Psy1을 분리하여 그 촉매적 특성에 관하여 조사하였다. 효소의 정체를 위하여 70g의 균체를 이용하였고, 300watt에서 6분간(2분간 3번씩) 열을 위헤서 초음파 마쇄하였다. 이것을 streptomycin sulfate 침전, ammonium sulfate 침전, phosphocellulose pll, DEAE-cellulose, hydroxyapatite, Sephadex G-100 column chromatography를 통해 정제하여 순수한 단백질을 얻었다. 그 단백실 subunit의 분자량은 0.1%의 SDS를 포함하는 polyacrylamide gel에서 전기 영동한 결과를 토대로 분석한 결과 약 50,000 dalton으로 추정된다.
이 효소의 촉매적 성질은 pH7에서 pH10 사이의 광범위한 pH 영역에서 안정하였고, 적정반응온도는 30℃에서 37℃였으며, 그 온도 안정성은 25℃에서 45℃ 사이로 나타났다.
이 효소는 20mM 이상의 MgCl_2, 25mM 이상의 NaCl에서 활성이 저해되었으며, 2-mercaptoethanol 400mM까지 첨가시 계속 활성을 보였고, 플라스미드인 pBR 322와 pUC 18, 그리고 pBS등을 절단할 수 있었다. Lamda DNA를 여러 종류의 제한효소로 절단하여 제한효소 지도를 작성한 결과 SalI의 isoschizomer로 확인되었고 염기서열의 조사 결과로도 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

A restriction endonuclease, PsyI, has been isolated from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, and its catalytic properties have been studied. This enzyme was purified through streptomycin sulfate and ammonium sulfate fractionation, phosphocellulose pll, DEAE-cellulose, hydroxyapatite and Sephadex G-100 column chromatography. It's molecular weight was about 50,000 dalton as determined by 7.5% polyacrylamide gel electrophoresis containing 0.1% SDS. In catalytic properties, PsyI shows stable at wide ranges of pH between 7.0 and 10.0 of temperature between 30℃ and 37℃, and its thermal stability is between 25℃ and 45℃ at the presence of 10 mM MgCl_2 PsyI essentially require Na salt for enzyme reaction, is rather inhibited in the high Na salt concentration. The presence of 2-mercaptoethanol is absolutely required for the enzyme activity. This endonuclease, PsyI was determined to be an isoschizomer of SalI from the results of the restriction mapping and DNA sequencing.