Directed evolution of Levan Fructotransferase
저자
발행사항
부산 : 부산대학교 일반대학원, 2006
학위논문사항
Thesis(Master)-- 부산대학교 일반대학원 : 미생물학과 2006. 2
발행연도
2006
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
대한민국
형태사항
49p ; 26cm
일반주기명
지도교수 :차재호
DOI식별코드
소장기관
효소의 활성이나 안정성, 특이성 등을 높여주기 위하여 효소를 개량시키는 방법 중에 random mutagenesis가 있는데, 이는 한 단백질의 유전자를 무작위적으로 돌연변이를 일으켜 그 기능을 연구하는 방법이다. 즉, random mutagenesis는 기능성 핵산이나 단백질에서 잔기들의 역할을 알아볼 수 있는 강력한 분석 도구로서 단백질의 in vitro evolution에 이용될 수 있다.
Levan은 β-2,6-linked fructose polymer에 분지된 β-2,1-linkage를 가지는 다당으로 식물이나 미생물에 의해 생산되어진다. Levan은 항암효과와 비소화성으로 식이섬유기능이 있으며 fructooligosaccharide (FOS)의 원료로 사용되어질 수 있어 각광받고 있다. 이러한 levan은 박테리아 유래 효소인 LFTase (Levan fructotransferase)에 의해 FOS의 한 종류인 DFA IV (Di-D-fructose-2,6':6,2'-dianhydride)로 분해되는 반면, LFTase와 같은 그룹에 속하면서 다른 활성을 가진 Levanbiohydrolase에 의해서는 F2(levanbiose)로 분해된다.
선행 연구에서, 두 효소의 차이점 중 LFTase가 levanbiohydrolase보다 N-말단에 51개의 아미노산이 더 있음을 알게 되었고 이 부위가 제거된 trucated mutant를 구축하였으나 활성에는 영향을 주지 않았다.
따라서 본 연구에서는 LFTase의 DFA IV 생산에 중요한 부위를 찾기 위해 random mutagenesis를 실시하였다. LFTase의 random mutagenesis는 error-prone PCR 방법으로 실시하였고, 다양한 부위가 바뀐 LFTase mutant library를 얻을 수 있었다. Screening 과정은 DFA IV와 F2의 가장 큰 차이점인 환원성 말단을 이용한 DNS reagent를 이용하여 실시하였고 이 중 positive clone은 TLC와 HPLC를 통해 반응 산물을 확인하였으며 DNA sequencing을 통해 바뀐 부위를 찾아내었다.
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