Application of GFP locus for gene Editing in Transgenic Cattle using CRISPR/Cas9 System
저자
Soo-Young Yum ; SongJeon Lee ; Hyun-Min Kim ; Choong-IL Lee ; WooJae Choi ; Ji-Hyun Lee ; Hee-Soo Kim ; Sang-Eun Hahn ; Seong-Jin Kim ; Goo Jang
발행기관
학술지명
권호사항
발행연도
2016
작성언어
English
주제어
자료형태
학술저널
발행기관 URL
수록면
166-167(2쪽)
제공처
CRISPR/Cas9-induced knock-out/-in can be occurred at specific locus in the genome by non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). Here, we demonstrate the targeted insertion into the specific loci of embryo fertilized by semen from transgenic cattle via CRISPR/Cas9 system. Recently, we published on the efficient generation of transgenic cattle using the DNA transposon system (Yum et al. Sci Rep. 2016 Jun 21;6:27185). In the study, eight transgenic cattle were born following transposon-mediated gene delivery system (Sleeping Beauty and Piggybac transposon system) via microinjection. In the analysis of their genome stability using next-generation sequencing, there was no significant difference in the number of genetic variants between transgenic and non-transgenic cattle. All the transgenic cattle have grown up to date (the oldest age: 33 months old, the youngest age: 15 months old) without any health issue. One of transgenic male cattle expressing GFP reached puberty and semen was collected. Over 200 frozen semen straws were produced and some were used for in vitro fertilization (IVF). On seven days after IVF, expression of GFP was observed at blastocyst stage and was seen in 80% of the embryos. Another application is to edit the GFP locus of the transgenic cattle because long-term and ubiquitous expression of transgene didn’t affect their health. In one cell stage embryos produced using GFP frozen-thawed semen, microinjection of sgRNA for GFP, Cas9, together with donor DNA that included RFP and homology arms to link the double-strand break of sgRNA target site into fertilized eggs resulted in expression of RFP. This indicated that the GFP locus of transgenic cattle shows potential candidates for stable insertion of the functional transgene. Knock-out/-in for editing GFP locus using CRISPR-Cas9 might be a valuable approach for the next generation of transgenic models by microinjection. In conclusion, we demonstrated P-112 that transgenic cattle via transposon system are healthy to date and germ-line competence was confirmed. The GFP locus will be used as the potential target site for future gene engineering via genome-editing technology. Finally, all those animals could be a valuable agricultural and veterinary science resource for studying the effects of gene manipulation on biomedical research and medicine. This work was supported by BK21 PLUS Program for Creative Veterinary Science and Seoul Milk Coop (SNU 550-20160004).
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