골수, 제대혈 및 가동화된 말초혈액에서 Megakaryocyte 집락의 형성능력 비교 = Direct Comparison of Megakaryocyte colony assay in Bone Marrow, Umbilical Cord Blood and Peripheral Blood Stem Cells

국문 초록 (Abstract)

연구배경 : MK 집락배양은 적절한 배양조건과 배양후 MK 집락을 확인하기 어려워 다른 집락배양에 비하여 늦게 시작하였다. 하지만 이러한 문제들이 해결되면서 최근에는 체외에서 MK를 증폭하거나 TPO, IL-11등과 같은 사이토카인의 사용으로 이식 후 혈소판의 감소를 극복하려는 시도들이 활발하게 진행되고 있다. 저자들은 MegaCult＾(TM)(Stem Cell Technologies Inc, Vancouver, Canada)를 이용하여 제대혈, 가동화된 말초혈액, 골수를 이용하여, 조혈원 간의 MK 집락 형성능력을 비교하였으며, 앞으로 이러한 방법을 생체 외 MK 증폭 실험 뿐만 아니라 혈소판질환의 병태생리를 연구하는 기초적인 자료로 사용하고자 한다.
방법 :　말초 조혈모세포는 정상인에게 G-CSF 300㎍을 5일간 피하 주사 한 후 혈액분반기를 이용하여 채취하였다. 골수는 동종 골수이식 시 공여자로부터 동의를 얻은 후 채취하였으며, 제대혈액은 정상 분만 후 태반과 제대로부터 얻었다. 단핵구와 CD34＾(+) 세포를 분리하여 MegaCult＾(TM)를 이용하여 MK 집락을 배양하고, 항 GPIIb/IIIa를 이용하여 이를 확인하고 도립현미경하에서 집락수를 관찰하였다.
결과 :
1) 단핵구를 이용한 MK 집락 비교에서 순수 MK, 혼합 MK 집락 모두 제대혈에서 가장 많은 집락 형성능을 보였고, 골수, 말초 조혈모세포 순이었다.
2) CD34＾(+) 세포를 이용한 MK 집락은 각 조혈원에서 양호하게 형성됨이 관찰되었고, 단핵구를 이용한 MK 집락 배양에서처럼 제대혈, 골수, 말초혈액 순으로 제대혈액내에서 가장 많은 집락 형성을 보였다.
3) 단핵구 또는 CD34＾(+) 세포를 이용한 집락 배양 시에도 MK를 포함한 전체 집락이 제대혈액에서 가장 많이 형성되었다.
결론 : 각 조혈원의 MK배양에 IL-3, IL-6, TPO가 포함된 MegaCult＾(TM)를 사용하였으며 배양된 집락중 megakaryocyte를 확인하기 위하여 항GPIIb/IⅡa 항체를 이용한 면역 조직학적 염색을 시행하였다. 저자들이 시행한 MK집락 배양과 GPIIb/IⅡa를 이용한 면역조직학적 염색은 혈소판의 병태 생리를 이해하고, MK 증폭을 포함한 이식 후 혈소판 회복을 증진시키기 위한 여러 가지 실험의 기초적인 자료가 될 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: In vitro colony assay procedures for detecting human erythroid and granulocyte-macrophage progenitors have been in widespread use for many years. However, the development of reproducible assay methods for human megakaryocyte (MK) progenitors lagged considerably behind. There are two main reasons for this: First, the growth conditions initially optimized for other blood cell lineages are not optimal for MK progenitor cell growth. Secondly, the specific recognition of MK colonies requires fixation of the cultures and immunocytochemical staining of the cells for MK-specific antigens. The Methocult^(TM) system for detcting human clonogenic MK progenitors uses a medium containing a defined serum substitude to minimize the inhibitory effects of factors like TGF-β that are found in most sera. Three categories of colonies can be identified in cultures set up with Methocult^(TM): pure MK colonies; mixed MK colonies (containing other lineages as well as MK); and non-MK colonies (containing only other lineages of cells).
Methods: This assay has been used to determine the range of MK progenitors present in a series of umbilical cord blood, peripheral blood and bone marrow samples. The MK colonies are detected by staining of the cells with a primary antibody to the MK-specific antigen GPIIb/IIIa (CD41).
Results: We enumerated pure CFU-MKs in G-CSF mobilized peripheral blood (MPB), BM and umbilical cord blood (UCB). CFU-MK were detected in MPB, BM, and UCB at incidences of 1.00±0.82, 6.75±2.22, 8.00±1.83 of 5×10⁴mononuclear cells and at incidences of 19.00±03.37, 40.33±17.21, 99.00±54.76 of 5×10³ CD34^(+) cells. The highest number of pure CFU-MK was seen in UCB. The other colony counts (mixed CFU-MK, non-MK CFU) were also higher in UCB than in MPB and BM.
Conclusion: We speculate that UCB should be better source of CFU-MK than any other stem cell sources.