Studies on the EfficientSeparation of Primordial Germ Cells and Introduction of Foreign DNA in the Chicken = Studies on the EfficientSeparation of Primordial Germ Cells and Introduction of Foreign DNA in the Chicken

국문 초록 (Abstract)

닭의 생식반월, 혈액, 그리고 원시생식기로부터 원시생식세포의 효율적 분리<br/>
본 연구는 다양한 발달단계로부터 원시생식세포를 분리하였다. 원시생식 세포가 가장 많이 분포하고 있는 일령을 선택하였다. 1일령 배자의 생식반월, 2.5일령 배자의 혈액 그리고 5.5일령 배자의 원시생식기를 이용하였다.<br/>
원시생식세포 분리 개수는 생식반월, 혈액, 그리고 원시생식기 각각 87±1.8, 103±4.0, 932±10.9개였다. 각 발달단계별 원시생식세포의 생존율은 약 70%로 비슷하였다. Ficoll방법의 개선으로 원시생식세포 분리 방법은 개선되어, 분리율은 생식반월, 혈액, 그리고 원시생식기가 각각 45±9.10%, 85±1.18%, 그리고 86±0.19%였다. 또한, 원시생식세포는 분리율을 높이기 위하여 마우스파이펫을 이용하여 개체로 분리하였다. 각기 다른 배발달 단계에 따라 분리한 원시생시세포 분리 방법은 종계의 보존 및 생식선 카이메라 생산에 유용할 것이다.<br/>
원시생식기 유래 원시생식세포 주입에 의한 외래 생식세포 확인 및 유전자 전이 형질전환 닭 생산은 유전자의 발현 및 기능을 연구하는데 매우 유용한 도구이다. 그러나 이러한 목적을 위하여 개발된 방법은 조류에 적용하기가 어렵다. 조류는 포유류와 달리 형태학적 발생학적 차이로 인하여 미세주입과 같은 방법으로 형질전환 닭을 생산하기가 매우 어렵다. 원시생식기 유래 원시생식세포의 발현과 성세포 발달은 형질전환 닭 생산에 가능성을 보여준다. 그러나 대부분의 유전자 전이가 초기 배자에서 일시적으로 발현되기 때문에 어렵다. 그리고 또한, 본 연구에서는 이렇게 유전자 전이 또는 외부에서 처리한 원시생식세포의 이동능력에 대하여 환인을 할 필요가 있었다. 그러므로, 외래 원시생식세포에 형광염색하여 주입하거나 수컷배자에 암컷 원시생식세포를 주입하여 DNA 검색하는 방법을 이용하여 외래 원시생식세포가 유전자 전이체로 사용할 수 있음을 확인하였다. 그리고 또한 전기 충격법을 사용하여 유전자를 전이 시킨 후 이를 주입하여 배자 발달단계에 따라 유전자 발현 유무를 확인하였다. 결론적으로 각기 다른 배발달 단계에서 분리된 원시생식세포 멸종 조류의 보존 및 생식선 카이메라 생산에 유용한 도구임을 확인하였고 궁극적으로 성숙된 닭의 정액에서 외래 유전자가 전이된 닭을 생산 할 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Efficient separation of primordial germ cells from chick germinal crescent, blood and gonad<br/>
This study was conducted to determine the embryonic stages for the isolation of the highest number of PGCs and to improve PGCs enrichment method. The primordial germ cells (PGCs) from different sources of chick embryos were isolated. The embryonic stage having the highest number of PGCs from each sources was selected; 1-day-old embryos for germinal crescent (stage 6-8), 2.5-day-old embryos for blood (stage 17-18) and 5.5-day-old embryos for gonad (stage 27-28). The number of PGCs from one embryonic germinal crescent, blood and gonad was about 87±1.8, 103±4.0, and 932±10.9, respectively. The viability of PGCs after Ficoll from each sources was similar, showing approximately 70%. The PGCs enrichment method was improved using Ficoll density gradient centrifugation. After this step, the purity of PGCs from germinal crescent, blood, and gonad was 45±9.10%, 85±1.18%, and 86±0.19%, respectively. Also, PGCs were picked up by mouth pipette to improve the purity. This improved method for the separation of PGCs from different sources will serve as a useful tool to preserve the foundation stocks of poultry and to produce germline chimeras.<br/>
Identification and introduction of foreign DNA in the recipient chicks<br/>
Expression of a foreign gene in embryos and embryonic germ cell as a gonadal PGCs would show the possibility to produce the transgenic chicken. However, transgenic chicken cannot be obtained using the transient transfection method by expression of early embryonic stage. And also, this studies must confirm the migration activity of foreign DNA transfected PGCs. Therefore, two methods of migration activity analysis were compared for the detection of exogenous PGCs. The labelled PGCs injected into 2.5-day embryos and then incubated until they reached stage 28, fluorescence was observed in the embryonic gonad of the embryos and W-specific DNA were not detected in blood and fibroblast cell of male embryos but embryonic gonad. Through this fact, gPGCs can be used as a genetic vector. In this experiment, foreign DNA was transfected into gPGCs using electroporation by Hong et al (1998). And these cells were injected into recipient embryos and estimated the efficiency of gene expression to the developmental stage, 6-day-old embryo, 10-day-old embryo and hatched chick. gPGCs transfected foreign gene producted lacZ gene were transferred sperm after sex maturation. This result indicated that gPGCs had characteristics of circulating PGCs and were useful genetic vector for the production of transgenic chicken. In conclusion, these results indicate that the improved method for the separation of PGCs from different sources will serve as a useful tool to preserve the foundation stocks of poultry and to produce germline chimeras.

목차 (Table of Contents)

• Abstract
  
• INTRODUCTION
  
• Matrials and Methods
  
• RESULTS AND DISCUSSION
  
• Reference
  
• 적요