Multiple detection of SARS-CoV-2 and spike D614G mutation using POCT real-time PCR

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Spike protein D614G mutation of Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is currently the most dominant virus form, Recently, it has been revealed that the mutation that is commonly displayed among the mutant viruses reported in India, the United Kingdom, South Africa, and Brazil is more than 10 times more infectious than the conventional virus. Whether these Spike protein D614G mutations affect symptomatology severity and mortality is not yet known, but when Spike protein D614G mutations began to spread, especially in Europe, compared to Europe and Asia. The reason for the relatively high mortality rate is speculated to be due to the Spike protein D614G mutation. To monitor these unpredictable Spike protein D614G mutations, we used probe based real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect SARS-CoV-2 and at the same time spike. An analytical method was developed to identify the D614G mutation. The Global Initiative for Sharing All Influenza Data (GISAID) was used to secure and analyze the SARS-CoV-2 nucleotide sequence database. Based on this, based on the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) and nucleocapsid (N) genes used for the detection of SARS-CoV-2, primer pairs and probe sets were produced, respectively. Based on the spike (S) gene used to detect the Spike protein D614G mutant, one primer pair and probe set were created. The probe's individual fluorescent label enabled multiple analyzes and used a microfluidic chip-based POCT real-time RT-PCR platform to reduce on-site detection time to 40 minutes. According to the analysis of this study, each primer pair and probe set showed high sensitivity and specificity, enabling high-speed / high-sensitivity on-site diagnosis. SARS-CoV-2 is expected to evolve into a more potent viral form by interacting with more immune systems in the future. Therefore, the laboratory analysis of the mutants used in this study is expected to be useful in a rapid and simple analytical method for tracking SARS-CoV-2 mutations.

국문 초록 (Abstract)

중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2의 스파이크 D614G 돌연변이는 현재 가장 지배적인 바이러스 형태가 되었고, 최근 인도, 영국, 남아프리카공화국, 브라질에서 보고된 변이바이러스 중에서 공통적으로 나타나는 돌연변이로 기존의 바이러스보다 10배 이상 감염력이 높은 것으로 밝혀졌다. 이러한 Spike protein D614G 돌연변이는 증상의 심각성과 사망률에 영향을 미치는지에 대한 여부는 아직 알려져 있지 않지만, 스파이크 D614G 돌연변이가 유럽을 시작으로 확산되기 시작하였을 때 유럽이 아시아에 비해 사망률이 상대적으로 높은 이유는 스파이크 D614G 돌연변이 때문인 것으로 추측되어 지고 있다. 이러한 예측 불가능한 스파이크 D614G 돌연변이를 모니터링 할 수 있도록 본 연구에서는 탐침 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응 기법을 활용하여 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2를 검출하고 동시에 스파이크 D614G 돌연변이를 식별하는 분석법을 개발하였다. 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2의 염기서열 데이터베이스 확보와 분석을 위해 국제인플루엔자정보공유기구를 이용하였다. 이를 바탕으로 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 검출에 사용되는 RNA 의존성 RNA 중합효소 유전자와 뉴클레오캡시드 유전자를 기반으로 각각 프라이머 쌍과 탐침을 제작하였으며, 스파이크 D614G 돌연변이 검출에 사용되는 스파이크 유전자를 기반으로 1개의 프라이머 쌍과 탐침을 제작하였다. 프로브의 개별 형광 라벨링은 다중 분석을 가능하게 하였으며, 미세유체 칩기반의 현장진단 역전사 실시간 중합효소연쇄반응 플랫폼을 사용하여 현장 검출 시간을 40분으로 단축시켰다. 본 연구 분석에 따르면 각 프라이머 쌍과 탐침은 높은 민감도와 특이성을 보여주었고, 고속/고감도의 현장 진단이 가능하도록 하였다. 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2는 앞으로 더 많은 면역체계와 상호작용함에 따라 더욱 강력한 바이러스의 형태로 진화할 것으로 예측된다. 따라서 본 연구에서 사용된 돌연변이 검사 분석은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 돌연변이를 추적하기 위한 빠르고 간단한 분석법으로 도움이 될 수 있을 것으로 예상된다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• I-1 Emergence of SARS-CoV-2 1
• I-2 Genome structure of SARS-CoV-2 1
• I-3 Spike protein D614G mutation of SARS-CoV-2 2
• I-4 Molecular diagnosis and point of care testing (POCT) 3
• I-5 TaqMan real-time PCR assay 7
• II. Materials and Methods 8
• II-1 Ethics statement 8
• II-2 Preparation of viral RNA samples 8
• II-3 Primer pairs and probe sets design and in silico analysis 9
• II-4 Basic experiment for standard curve 9
• II-5 Evaluation of primers and probe sets using viral RNA samples 10
• III. Results 12
• III-1 Primer pairs and probe sets 12
• III-2 Standard curves 16
• III-3 One–step real-time PCR 23
• IV. Discussion 28
• References 30
• 국문요지 32