Development of sample pretreatment and molecular diagnostic microfluidic system to improve pathogen detection
저자
발행사항
Seoul : Sungkyunkwan university, 2017
학위논문사항
Thesis (M.A.)-- Sungkyunkwan university : Department of Mechanical Engineering 2017. 8
발행연도
2017
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
서울
기타서명
병원체 검출 향상을 위한 시료 전처리 및 분자 진단 미세유체 시스템 개발
형태사항
xiii, 103 p. : ill., charts ; 30 cm
일반주기명
Adviser: 박성수
Includes bibliographical references
DOI식별코드
소장기관
본 연구의 목적은 기존 분자진단검출법의 검출한계 이하로 존재하는 병원체를 검출 하기 위해 요구되는 병원체 농축과 핵산추출 공정을 자동화한 미세유체소자기반 시스템을 제작하여 감염성 질환을 조기 진단할 수 있는 플랫폼을 개발하는 데 있다.
감염성 질환의 조기진단을 위해 환자의 혈액과 객담은 병원체를 검출하기 위한 최선의 시료로 간주되고 있다. 이러한 임상시료에서 병원체를 검출하기 위해 중합효소 연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR) 과 같은 분자 진단이 주로 이용된다. 하지만 특정 병원체는 이러한 분자 진단의 검출 한계보다 낮은 수로 존재하며 검출이 용이하지 않다. 때문에 종종 그 병원체 수를 검출한계 이상으로 늘리기 위해 증균 과정이 요구된다. 이 문제 외에도 혈액 및 객담에는 DNA 증폭과 같은 분자 반응을 저해하는 생체분자들이 존재하여 분자 진단에 의한 병원체를 탐지를 방해한다. 이러한 문제를 해결하기 위해 자성 나노 입자에 항체를 고정화 시켜 자력에 특정 병원체를 선별적으로 농축 시키거나 자기 실리카 비드 (MSB)의 양이온을 이용하여 음이온의 핵산을 정제하는 방법이 독립적으로 사용되었다. 이러한 문제들을 해결하기 위해 자성나노입자에 항체를 고정시켜 타겟을 농축하고 분리할 수 있는 자성 분리 기법 (Immunomagnetic separation; IMS) 과 자성실리카 비드 (Magnetic silica beads; MSBs)를 이용하여 DNA만을 분리시킬 수 있는 비드 기반 DNA 정제 방법이 사용되어 왔다. 그러나 이러한 기술은 복잡하고 원심 분리기와 같은 대형 장비를 사용해야 한다. 기존의 전처리 방법의 번거로움과 복잡성을 개선하기 위해 IMS와 MSB 핵산 정제 기술 및 PCR을 마이크로 유체 시스템에 통합하기위한 많은 노력이 있었다. 그러나 하나의 미세유체 시스템에서 임상시료 내 병원체 농축 및 핵산정제, 핵산 증폭 등의 모든 과정이 유기적으로 연결되어 실행되도록 개발된 바 없어 분자진단의 편리함과 신속함이 최우선으로 요구되는 병원과 진단연구시설에서 미세유체시스템이 잘 활용되고 있지 않다. 본 연구에서는 기존의 시료 전처리 방법의 복잡성과 복잡성을 개선하기 위해 IMS 및 MSB 기반 핵산 정제 기술 및 PCR을 하나의 마이크로 유체 시스템으로 통합하여 분자 진단에서 병원체 검출 한계를 향상시키는 마이크로 유체 시스템을 개발하였다.
제 1 장에서는 임상 시료에서의 시료 전처리는 물론 분자 검출을 위한 기존 기술을 소개한다. 또한, 마이크로 유체 시스템의 제조 및 작동을 위한 일반적인 방법이 소개된다.
제 2장에서 나는 인플루엔자 바이러스의 검출 향상을 위해 시료를 농축하며, 농축 후 온칩 PCR 을 이용하여 검출하는 시스템을 개발하였다. 기존 면역자성 분리 기법 과 중합효소 연쇄반응을 이용하여 바이러스 농축 및 온칩 PCR 시스템을 개발하였다. 이 미세유체 시스템은 바이러스 샘플을 주입하는 하나의 마이크로 채널과 항체 고정 나노입자에 의해 바이러스 입자를 농축할 수 있는 사다리꼴 모양의 챔버로 이루어져 있다. 이 시스템은 타액 10 mL 내 바이러스 입자의 농도를 30분 내에 약 80 배정도 농축할 수 있다. 일반적인 분자진단 방법으로는 검출할 수 없는 10 TCID50/mL (50% tissue culture infective dose) 를 2 시간 내에 검출할 수 있었다.
제 3장에서는 2장에서 설명한 미세 유체 시스템에서 열순환 조절의 어려움과 유체 증발 문제 등으로 조절이 어려운 PCR 공정을 빼고 단순한 핵산정제과정을 추가하여 임상시료의 전처리과정을 보다 고도화 하여 민감도를 개선한 연구 결과를 보고한다. 제 3장에서는 2장에서 소개된 미세유체시스템 내에서 열처리과정과 증발문제 등의 조절이 어려운 PCR과정을 보다 단순한 핵산정제과정으로 교체하여 병원체 검출의 민감도를 개선한 연구결과를 보고하였다. 제2장에서 개발된 미세유체시스템에서 PCR과정을 빼고 핵산추출과정을 추가하였다. 이 새로운 미세유체시스템에서 자성실리카 비드를 이용하여 자성으로 농축된 세균으로부터 DNA를 효율적으로 분리함으로써 PCR검출에 요구되는 고농도 고순도 핵산을 얻을 수 있었다. 본 시스템을 이용해 시료로부터 세균농축과 핵산정제가 완료 시 PCR과 정량적 PCR (quantitative PCR, qPCR) 방법을 활용해 병원성 대장균 O157:H7과 포도상구균을 각각 1 CFU (colony forming unit)/mL, 100 CFU/mL 농도까지 검출할 수 있음을 확인하였다. 이러한 본 시스템을 활용하지 않은 시료에서 검출한 경우 보다 그 민감도가 약 천배 정도 향상된 것이다.
본 연구를 통해 개발된 시료 전처리 시스템은 병원체의 농축과 핵산 정제를 통해 분자진단 검출의 민감도를 획기적으로 개선하는 데 활용될 수 있다. 그러므로 본 시스템은 추후 자동화과정과 많은 임상시료에 대한 엄격한 적용성 테스트를 통해 병원체가 검출한계 이하로 존재하는 임상시료에서 시료전처리 플랫폼이 될 수 있을 것으로 전망된다.
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