글루코스아미노글리칸 생합성 기전을 이용한 피부주름개선화장품의 효력시험 평가방법 연구 = Study on the efficacy test of anti-wrinkle cosmetics regarding glycosaminoglycan synthesis
본 연구를 통해 항 주름 개선 기능성 화장품의 효력에 관한 효율적이고 과학적인 심사기준을 확보하고 화장품의 품질을 향상시키는 구체적인 기준을 탐색하고자 하였다. 피부조직에서 대표적인 글루코스아미노글리칸(GAG)인 hyaluronic acid의 생합성 기전과 주름개선효과간의 상호 연관성을 알아보는 기초적 접근방법으로서 연구결과들 간에 서로 비교가능하고 유의한 재현성을 갖는 간단한 측정기법을 제시하고자 하였다. 측정시험에 사용된 시료는 3종의 vitamine-A 유도체인 retinol, retinyl palmitate, polyethoxyretinide retinamide와 hydroxyproline로서 주름개선 기능성 화장품에 흔히 사용되는 시료였으며 효소면역분석법으로 hyaluronic acid의 정량적 변화를 평가하였다. 표준화된 시험지침을 확보하고 객관적인평가지표를 발굴하고자 세포배양과정에 필수적으로 고려해야 할 조건으로서 표준 시험세포주의 선택을 위해 3가지 다른 섬유모세포를 시험하였고, 배양실험과 정량측정에 미치는 제반인자들(세포분주 초기조건, 배양기간, 시료처치시점, 분석용 시료의 회수시점)을 검토하였으며, 생체피부 평가시험을 통해 세포배양 정량측정시험의 결과가 적용될 수 있는지 알아보았다. 시료처치에 따른 섬유모세포배양 측정시험에서 hyaluronic acid의 정량분석은 유용하였고 생체피부 평가시험과 상응하는 결과로서 vitamine-A 유도체의 기존 효과도 확인할 수 있었다. 향후 심사기관에서 활용할 수 있는 기능성화장품의 효력평가지침 또는 장업계의 연구자간에 개별적으로 수행되는 성분효과의 판정기준을 기술적으로 개선, 보완하는 방법으로 제시하여 임상적 평가기준을 개선하는데 기여할 수 있다.○ 연구목표 : 기능성화장품의 효력판정에 관한 효율적이고 과학적인 심사기준을 확보하고 소위 항주름화장품의 품질을 향상시키는 구체적인 기준을 확립하는데 있어서 글루코스아미노글리칸(GAG)의 생합성 기전을 통해 주름개선효과에 응용할 수 있는지 상호 연관성을 알아보고자 한다. 특히 단위 실험실 간에 직접 비교가능하고 유의한 재현성을 갖는 간단한 측정기법을 제시하기 위해, 진피내 GAG의 대부분을 차지하는 성분인 hyaluronic acid의 정량적 발현도를 효소면역분석법으로 측정하여 평가하는 배양시험 방법을 개발하는데 목적이 있다.
○ 연구내용 : 연구는 시험관내 실험법을 근간으로 하여 GAG의 정량분석을 수행하는데 인체피부에서 직접 얻은 섬유모세포 혹은 표준세포주의 배양과정에 항주름 효과가 있을 것으로 추측되는 성분(retinol, retinyl palmitate, hydroxyproline, polyethoxyretinide retinamide)을 적용하여 생합성되는 hyaluronic acid의 정량적 발현을 선택적으로 측정한다. 배양시험에 이용할 세포의 종류와 선택기준을 확인하기 위해 인체유래 섬유모세포를 신생아에서 획득한 것과 피부노화가 명백히 출현하는 40대 후반 성인으로부터 얻었고 표준세포주로는 akdntm 유래의 NIH 3T3 cell을 사용하였다. 배양시기와 약물처치에 따른 생합성의 변동양상 등 제반시험조건을 검토하여 그 효력을 객관적으로 검증하는데 중요한 방법을 찾는다. 또 항주름 효과유도성분을 생체피부에 직접 적용하여 처치 전, 후의 차이를 실제 구조해부학적 변화와 함께 평가함으로서 시험관내 실험결과와 유의한 연관성을 탐색한다. 항주름 성분간 효력의 비교가 가능하고 유의한 재현성을 확보하려면 표준화된 시험지침과 객관적인 평가지표로서 정량적 측정기법과 임상적 평가기법이 밀접한 관계를 갖는 시험방법을 구축하고자 한다.
(1) 시험관내 실험법에 의한 hyaluronan의 정량적 평가의 표준화
(2) 생체피부 평가시험
○ 연구성과(응용분야 및 활용범위포함) : 피부노화와 주름발생에 관여하는 GAG의 생화학적 분석기법이 매우 복잡하고 연구방법에 따라 분석결과에 대한 편차가 적지 않아 개별 연구자들이 공유할만한 시간적, 경제적으로 효과적인 측정기법의 개발이 필요하다. 본 연구는 진피에 존재하는 GAG 중 가장 많은 부분을 차지하며 피부생리대사에 현저한 영향을 주는 hyaluronan만을 선택적으로 측정하는 방법을 확립함으로서, 항주름 효과를 주장하는 성분의 효력평가에 응용할 수 있다. 이를 통해 심사기관에서 활용할 수 있는 평가지침을 개선하는 효과를 기대할 수 있으며 장업계의 연구자들이 항주름 기능성 화장품의 유효성에 관한 구체적인 제반 자료들을 검토할 수 있고, 연구자간 개별적으로 수행되는 효력판정기준을 기술적으로 개선, 보완하는 방법으로 제시하여 관련기관에서 활용할만한 임상적 평가기준을 개발하는데 기여할 수 있다.
Aging change of dermal connective tissue, where the glycosaminoglycans(GAG) or proteoglycans act as a major modulator, also causes the skin surface change such as wrinkles, roughness, etc. Thus it is mandatory to develop the reliable, standardized efficacy evaluation of antiwrinkle cosmetic products by analyzing the amount of GAG synthesis under well controlled experimental condition. We have measured the hyaluronic acid (HA), a largest portion of GAG synthesized from dermal fibroblast, to develop a time saving, relatively easy compare to traditional multi-step steady biochemical measurement, yet accurate in vitro test protocol by using HA binding protein based ELISA. Vitamine-A derivatives such as retinol, retinyl palmitate, polyethoxyretinide retinamide and hydroxyproline were used for the test standard. The three kinds of fibroblast including the primary culture from neonates and olds and mouse origin cell line (NIH 3T3 cell) were evaluated to find the optimal condition for measuring HA. The kinetics of cell culture, time-course pattern of HA production, and reliable sampling time for the quantitative assay were determined. The results of in vitro experiment were also validated with in vivo evaluations of histometric anaylsis. The present test protocol would extend or reinforce the current evaluation system of regulatory agencies as well as reduce the time and cost for a new product development at cosmetic industry, while further efforts to correlate the factors between in vitro and in vivo are also required.
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