세포 내 유비퀴틴 레벨이 비소에 의해 유발된 세포 독성 완화를 위한 프로테아좀의 기능에 미치는 영향 : Effect of cellular ubiquitin levels on the proteasomal function to confer resistance against cytotoxicity induced by arsenite

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Upon exposure to arsenite, the polyubiquitin gene Ubc is upregulated. However, the detailed mechanism how Ubc upregulation occurs and the role of ubiquitin (Ub) in cytoprotection against arsenite-induced toxicity remain unclear. Previously, reduced viability was shown in Ubc−/− MEFs (mouse embryonic fibroblasts) upon exposure to arsenite, although the Nrf2-Keap1 pathway was activated as an antioxidant response. Interestingly, upon exposure to arsenite, levels of Ub conjugates increased significantly in an Nrf2-independent manner, which was due, at least in part, to the reduced proteasomal activity. I also confirmed the impairment of ubiquitin-proteasome system (UPS) under arsenite exposure, through both the demonstration of increased fluorescence from unstable GFP-CL1 and autoubiquitination of ADRM1 (adhesion regulating molecule 1), a proteasomal ubiquitin receptor of 19S regulatory particles. Attenuated function of the proteasome in Ubc−/− MEFs resulted in more misfolded proteins under exposure to arsenite, increasing the likelihood of protein aggregates formation. Nevertheless, increased autophagic activity to clear these protein aggregates was not observed in Ubc−/− MEFs, but rather the aggregates accumulated inside the cells and possibly caused severe cytotoxicity. Therefore, reduced viability of Ubc−/− MEFs under oxidative stress may not be due to dysregulation of the Nrf2-Keap1 pathway, but mostly to the cytotoxicity caused by the protein aggregates.

국문 초록 (Abstract)

비소 처리 하에서 폴리유비퀴틴 유전자 Ubc는 상향 조절된다. 그러나 Ubc의 상향 조절이 일어나는 자세한 메커니즘뿐만 아니라 비소에 의해 유발된 독성으로부터 세포를 보호하는 과정에서의 유비퀴틴의 역할은 아직 밝혀져 있지 않다. 먼저, Nrf2-Keap1 경로가 항산화 반응으로써 활성화되어 있음에도 불구하고, 비소 처리 하에서 Ubc 결손 생쥐 태아의 섬유아세포의 생존력이 감소하는 것이 관찰되었다. 흥미롭게도, 유비퀴틴 복합체의 레벨은 비소 처리에 의하여 Nrf2-비의존적으로 크게 증가하였는데, 이는 적어도 어느 정도는 프로테아좀의 감소된 활성 때문이었다. 또한 비소에 의한 유비퀴틴-프로테아좀 시스템의 손상을 불안정한 GFP-CL1의 형광 증가와, 19S 조절성 입자의 유비퀴틴 수용체인 ADRM1의 유비퀴틴화를 통해 확인하였다. Ubc 결손 생쥐 태아의 섬유아세포 내 프로테아좀의 기능 약화는 비소 처리 하에서 잘못 접힌 단백질들을 더 많이 만들어내고 결과적으로 단백질 응집체들이 형성될 가능성을 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 이러한 단백질 응집체들을 제거하는 데 필요한 오토파지 활성의 증가는 Ubc 결손 생쥐 태아의 섬유아세포에서 관찰되지 않았고, 오히려 응집체들은 세포 내부에 축적되어 심각한 세포독성을 잠재적으로 유발했다. 따라서, 산화 스트레스 하에서 Ubc 결손 생쥐 태아의 섬유아세포가 보이는 생존력 감소는 아마도 Nrf2-Keap1 경로의 조절 이상 때문이라기보다는, 주로 단백질 응집체들에 의해 유발된 세포독성 때문이라고 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 2. MATERIALS AND METHODS 4
• 3. RESULTS
• 3.1. Reduced viability of Ubc−/− MEFs under oxidative stress induced by arsenite 11
• 3.2. Increased Ubc expression by activation of the Nrf2-Keap1 pathway 11
• 3.3. Inefficient polyubiquitination of Nrf2 and higher basal levels of Nrf2 targets in Ubc−/− MEFs compared to control MEFs 12
• 3.4. Increase of Ub conjugates under arsenite exposure is mediated by Nrf2-independent pathway 13
• 3.5. Decreased proteasomal activity in Ubc−/− MEFs under arsenite exposure 14
• 3.6. Demonstration of impaired UPS under arsenite exposure by both increased fluorescence from unstable GFP-CL1 and autoubiquitination of ADRM1 15
• 3.7. Decreased polyubiquitination of misfolded proteins in Ubc−/− MEFs generated under oxidative stress induced by arsenite 16
• 3.8. Increased formation of large-sized Ub-positive puncta upon arsenite exposure and their delayed clearance in Ubc−/− MEFs 16
• 4. DISCUSSION 38
• 5. REFERENCES 41
• ABSTRACT IN KOREAN 47