인체 ${\alpha}1$-antitrypsin cDNA의 분리 및 E.coli 내에서의 발현
저자
이상철 ; 유명희 ; Lee, Sang-Chul ; Yu, Myeong-Hee
발행기관
학술지명
권호사항
발행연도
1989
작성언어
Korean
자료형태
학술저널
수록면
148-153(6쪽)
제공처
소장기관
인체 간 cDNA library로부터 올리고 뉴클레오티드 프로브를 이용하여 ${\alpha}1$-antitrypsin (${\alpha}1$-AT) cDNA를 지닌 파지 클론을 스크린하였다. 선별된 클론에는 1.3 k bp의 DNA가 삽입되어 있었으며 이를 pUC9 벡터에 다시 클론닝하여 분석한 결과 이미 보고된 ${\alpha}1$-AT cDNA 서열과 일치함을 알 수 있었다. ${\alpha}1$-AT cDNA를 E. coli에서 발현시키기 위해 택 (tac) 프로모터에 의해 전사가 활성화되도록 발현벡터 pT-AT를 제조하였다. 플라스미드 pT-AT에 의해 형질전환된 E. coli JM109 균주에서 재조합 단백질의 발현을 유도한 결과 ${\alpha}1$-AT의 활성이 검증되었으며, 발현된 ${\alpha}1$-AT는 사람 피에서 정제한 ${\alpha}1$-AT와 그 면역학적 특성이 동일함을 알 수 있었다. 또한 같은 세포 추출액을 SDS-polyacrylamide 젤 전기영동법으로 분석한 결과 Coomassie Brilliant Blue로 단백질 밴드를 염색했을 때는 발현된 ${\alpha}1$-AT를 검증할 수 없었으나, ${\alpha}1$-AT에 대한 rabbit IgG 항체와 펄옥시다제가 연결된 anti-rabbit IgG goat 항체를 사용하여 웨스턴 블릿을 한 결과 ${\alpha}1$-AT 밴드가 기대했던 분자량 위치에서 확인되었다. 이와 같이 생산된 재조합 ${\alpha}1$-AT는 본래의 ${\alpha}1$-AT보다 분자량이 작은 것으로 나타났는데 이는 E. coli 세포내에서 발현된 ${\alpha}1$-AT는 glycosylation이 안된 형태의 것이기 때문일 것이다.
더보기Human ${\alpha}1$-AT cDNA was screened from human liver cDNA library, by use of oligonucleotide probes. DNA insert of 1.3 kbp from a positive clone was subcloned into pUC9 plasmid and was analyzed by restriction enzyme digestion and partial DNA sequencing. The obtained gene was identical to human ${\alpha}1$-AT cDNA reported previously. In order to express ${\alpha}1$-AT cDNA under regulation of tac promoter, expression vector pT-AT was constructed. E. coli JM109 cells transformed with pT-AT showed ${\alpha}1$-AT activity upon induction of recombinant protein synthesis. The recombinant ${\alpha}1$-AT was immunologically identical to authentic ${\alpha}1$-AT that was purified from human blood. When the recombinant cell lysates were analyzed on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, the expressed ${\alpha}1$-AT was not detected by staining with Coomassie Brilliant Blue. However Western blotting of the same gel, using rabbit IgG against ${\alpha}1$-AT and peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody, showed the existence of ${\alpha}1$-AT at the expected molecular weight region. Molecular weight of recombinant ${\alpha}1$-AT was slightly lower than that of authentic ${\alpha}1$-AT; which presumably was due to lack of glycosylation inside E. coli cells.
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