Screening of class D β-lactamase genes from metagenome data of marine environment
저자
발행사항
서울 : 중앙대학교 대학원, 2021
학위논문사항
학위논문(석사)-- 중앙대학교 대학원 : 시스템생명공학과 시스템생명공학전공 2021. 2
발행연도
2021
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
서울
기타서명
해양 환경의 메타 유전체 데이터로부터 class D β-lactamase 유전자 스크리닝
형태사항
viii, 77장 : 삽화(일부천연색), 도표 ; 26 cm
일반주기명
중앙대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다
지도교수: 설우준
참고문헌수록
UCI식별코드
I804:11052-000000234202
DOI식별코드
소장기관
최근에는 인간, 동물, 환경 건강을 아우르는 'One Health' 접근법의 중요성에 대한 인식이 높아지고 있으며, 병원 환경뿐만 아니라 자연 환경에서도 항생제 내성에 대한 연구가 진행되고 있다. 해양 환경은 항생제 내성 유전자 (ARG)의 유전적 저장소로보고되었지만 해양 환경에서 ARG에 대한 연구는 다른 환경에 비해 여전히 부족하다. Class D β-lactamase는 최후의 항생제 (carbapenem)를 분해하는 효소를 포함하여 좁은 스펙트럼에서 확장 된 스펙트럼에 이르기까지 다양한 항생제에 내성이 있다. 본 논문에서는 해양 환경에서 class D β-lactamase 유전자의 분포와 다양성을 메타 게놈 분석을 이용하여 조사 하였다.
240개의 해양 환경 메타 게놈에서 CARD 데이터베이스 시퀀스와 E-value < 1e-10, identity > 70 %, query coverage > 70 %, 그리고 subject coverage > 70 %의 조건에서 검색하여 class D β-lactamase 유전자 39개가 검출되었다. 부분 서열 유전자 및 중복 서열 유전자를 제외하고 18개의 class D β-lactamase 유전자를 뉴클레오타이드 서열로 합성하여 단백질의 발현 및 활성 실험에 이용하였다. 합성된 class D β-lactamase 서열은 pET28a(+)에 cloning하여 발현균주인 E.coli BL21 (DE3)에 transformation하였다. Class D β-lactamase gene을 삽입한 recombinant plasmid를 포함하는 E. coli BL21 (DE3)는 SDS-PAGE를 통해 class D β-lactamase 유전자의 발현을 확인하였다. 18개 중 14개의 재조합 균주에서 발현 된 것으로 보이는 β-lactamase 단백질 발현이 관찰되었다. 단백질이 발현된 재조합 E. coli을 대상으로 Muller-Hinton 배지에서 8가지 β-lactam 항생제 (ampicillin, ticarcillin, Cefepime, Ceftazidime, Cefotaxime, Aztreonam, Imipenem, Meropenem)에 대해 디스크 확산법으로 항생제 감수성을 검사하였다. 14종 중에 8종에서 ampicillin과 ticarcillin에 대해 내성을 확인하였다. 최소 억제 농도 (minimal inhibitory concentration) 테스트에서 6 개의 재조합 체가 pET28a를 가지는 표준 E. coli BL21 (DE3)과 비교하였을 때 ampicillin 및 ticarcillin에 대한 항생제 내성을 나타냈다 (1024 μg / ml AMP, 1024 μg / ml TIC). 고성능 액체 크로마토그래피 및 자외선 분광 광도법으로 분석한 결과 8종에서 ampicillin 가수분해 활성을 확인했다. 본 연구는 해양 메타게놈을 통해 발견 된 class D β-lactamase 유전자는 이미 보고된 β-lactamase와 70 % 이상의 서열 동일성을 보이지만 실제 발현과 활성에는 차이가 있었다. 다양한 환경에서 메타게놈 방법을 사용하여 방대한 양의 데이터가 나오고 있다. 메타 게놈을 통해 탐색된 유전자는 잠재적 저항성에서 그치는 것이 아니라 기능적인 연구가 함께 진행되는 것도 중요함 일임을 시사한다.
Recently, there has been increased awareness of the importance of the 'One Health' approach that encompasses human, animal, and environmental health, studies on antibiotic resistance not only in the hospital environment but also in the environment are being conducted. The marine environment has been reported as a genetic reservoir for antibiotic resistance genes (ARGs), but research on ARGs in marine environments is still lacking compared to other environments. Class D β-lactamase is resistant to a variety of antibiotics, from narrow-spectrum to expended-spectrum, including enzymes that break down the last-resort antibiotic (carbapenem). In this thesis, the distribution and diversity of class D β-lactamase genes in the marine environment were investigated using metagenome analysis.
In 240 marine environment metagenomes, compared with the CARD database sequence of class D β-lactamase genes, 39 were detected under the conditions of E-value < 1e-10, identity > 70 %, query coverage > 70 % and subject coverage > 70 %. Excluding partial sequence genes and overlapping sequence genes, 18 class D β-lactamase genes were synthesized as nucleotide sequences and used for protein expression and activity experiments. Recombinant E. coli BL21 (DE3) with the class D β-lactamase containing plasmids confirmed the expression of class D β-lactamase gene through SDS-PAGE. Of the 18 recombinant strains, 14 β-lactamase protein expressions that appeared to be expressed were observed. Antibiotic susceptibility to 8 β-lactam antibiotics (ampicillin, ticarcillin, cefepime, ceftazidime, cefotaxime, aztreonam, imipenem, meropenem) in Muller-Hinton agar plate for the expressed recombinant E. coli BL21 (DE3) was tested by disc diffusion assay. Resistance to ampicillin and ticarcillin was confirmed in 6 out of 14 species. In the test of minimum inhibitory concentration, 6 recombinants showed antibiotic resistance to ampicillin and ticarcillin compared to standard E. coli BL21 (DE3) with pET28a (1024 ug/ml AMP, 1024 ug/ml TIC). As a result of analysis by high-performance liquid chromatography and ultraviolet spectrophotometry, ampicillin hydrolysis activity was confirmed in 4 species. Although the class D β-lactamase gene found through marine metagenome shows above 70% sequence identity to known β-lactamase, there were differences in actual expression and activity. In various environments, a vast amount of data is coming out using the metagenome method. It is also important that not only potential resistance, but also functional studies proceed together.
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