(A) study on the clinicopathological feature and diagnostic methods of ALK gene mutation in Korean with non-small cell lung cancer

국문 초록 (Abstract)

연구배경 및 목적: 폐암은 전 세계적으로 가장 흔한 악성종양이며 암으로 기인한 사망의 가장 많은 원인이다. 우리나라에서도 매년 발생빈도와 사망률이 증가하는 추세이며 2005년에는 남녀 모두에서 암으로 인한 사망의 가장 흔한 원인으로 조사되었다. 최근 비소세포폐암의 발생에 직접 관여하여 소위 “growth driver"의 역할을 하는 다양한 유전자들의 돌연변이가 계속 발견된 것은 비소세포폐암에 대한 효과적인 새로운 치료를 개발하고 치료 반응을 예측할 수 있는 생물학적 표지자를 발견하기 위한 지속적인 노력의 결과라고 할 수 있을 것이다. EML4 유전자와 anaplastic lymphoma kinase (ALK) 의 융합 유전자인 EML4-ALK 는 2007년 ALK 유전자의 kinase 활성의 증가가 세포 증식과 암발생을 일으키는 강력한 발암인자임이 알려졌다. ALK 돌연변이의 빠르고 정확한 진단과 관련 유전자 돌연변이들의 발견은 환자에게 적절한 표적치료를 신속하게 시행함으로써 예후를 향상 시킬 수 있다. 이에 ALK 유전자 및 이와 관련된 돌연변이들의 발생 현황 및 돌연변이 상호간의 관계 및 환자의 임상적, 조직학적, 면역조직 화학적 특성을 알아보고 현재 가장 많이 사용하고 있는 기존 진단법인 ALK FISH 와 ALK IHC 에 따른 생존율 차이를 알기위해 Kaplan-Meier 생존분석을 시행하여 비교 조사하였다. 또한 ALK 돌연변이의 새로운 진단기준(Gold standard)으로써 차세대염기분석(NGS) 의 가능성과 현재의 위치, 미래의 가능성 등을 타진해 보고자 하였다.

재료 및 방법: 2012년부터 2018년까지 고려대학교 구로병원 인체유래물은행에 수집, 보관된 비소세포암 중 ALK 유전자 돌연변이를 fluorescence in situ hybridization(FISH) 검사로 확인할 수 있었던 482증례를 대상으로 하였다. H&E 및 면역조직화학염색의 유리 슬라이드를 리뷰하여 병변의 조직학적 유형과 면역조직화학적 특징을 확인하고 기술하였다. 모든 검체에 해당하는 환자의 나이, 성별, 흡연력, 병기, 생사여부에 대한 정보를 조사하였고 ALK 유전자 전위가 있는 폐선암 5증례와 전위가 없는 선암 5증례를 차세대염기서열분석을 이용하여 ALK 유전자 관련 돌연변이를 관찰하고 비교하였다. ALK 유전자 관련 돌연변이에 관한 부족한 데이터를 보완하기 암유전체지도(TCGA)를 이용하여 594 명의 폐선암 환자를 조사하였으며 이번연구에 포함된 482명중 표적치료를 시행한 환자를 제외한 471명을 대상으로 ALK FISH 와 ALK IHC 의 따라 Kaplan-Meier 생존분석을 비교 조사하였다.

결과: ALK 전위와 관계없이 두군 모두 남성에서 발생률이 높게 나타났으나 ALK 전위양성의 경우 전위음성에 비해 여성에서 발생비율이 조금 더 높았다(p<0.001). 또한 ALK 전위양성의 경우 연령은 34~80세까지 폭넓게 분포하였으며 평균은 60.7세로 ALK 유전자 전위가 없는 경우보다 의미 있게 어린 것으로 나타났다(p<0.001). 흡연과 ALK 전위의 통계적 의미는 없었으며 폐암 진단시에 ALK 유전자 전위가 양성인 경우가 음성보다 임파선 전이가 많았고 III, IV 기의 높은 병기 (higher stage) 상태임을 알 수 있었다(p<0.001). ALK 양성 검체의 경우 조직학적으로 고형암 (solid), 포상형 (acinar), 사상형 (cribriform pattern), 미세유두형 (micropapillary pattern), 유두형


(papillary pattern) 등이 많았고 면역조직화학검사 결과 TTF-1, Napsin 이 의미있게 높은 것으로 나타났으나 두 가지 모두 선암에서 증가하는 지표들로 ALK 특이적인 관련성은 없었다. NGS 실험 결과 ALK 양성 검체에서는 EGFR, BRAF, KRAS 등 동반 유전자돌연변이가 관찰되지 않았으며, ALK 음성의 경우 2건의 검체에서 EGFR 돌연변이 (EGFR L858R, EGFR 19 Del)와 ERBB2 돌연변이 ( ERBB2 :A775_G776 ins YVMA)가 관찰되었고, 1건의 검체에서 각각 KRAS 돌연변이 (KRAS : G12D)와 기존 검사법에서 확인할 수 없었던 TPM3-NTRK1 융합이 관찰되었다. EML4-ALK 융합을 진단함에 있어서 기존 검사법인 FISH 와 NGS RNA 패널 분석 간에 큰 차이를 보였다. 그러나 ALK IHC는 1예를 제외하고는 NGS RNA 패널과 전부 일치하였다. 암유전체지도를 이용한 594 명의 폐선암 환자 조사에서도 ALK 특이적인 고발현 유전자나 Signaling pathway 관련 유전자 등의 돌연변이는 동반되지 않는 것으로 나타났다. Kaplan-Meier 생존분석결과에서는 ALK IHC 만 양성인 경우의 평균 생존율인 34.412 개월로 ALK FISH 만 양성인 경우의 평균 생존율은 40.718 개월보다 짧았다(p<0.001).

고찰: ALK 유전자 변이는 강력한 발암인자로서 ALK 특이적인 임상적, 조직학적, 면역조직화학적특징을 지니고 있으며 이들 특성은 ALK 진단과 밀접하게 연관되는 것을 알 수 있었다. ALK 유전자 돌연변이의 진단에 있어서 최근까지 ALK 돌연변이 진단의 Gold standard 였던 단독 ALK FISH 대신에 ALK IHC 병합이 더욱 정확하고 효과적인 진단법이 될 수 있으며, 더 많은 연구와 제도적 문제가 보완된다면 NGS 도 훌륭한 ALK 진단법으로 Gold standard 로써 세대교체 가능성이 충분하며 이번연구가 파일럿 테스트로써의 역할을 할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Introduction: Lung cancer is the most common malignancy in the world, accounting for leading portion of the cancer-related death. In Korea, the incidence of lung cancer has been continuously increased, becoming the most frequent cause of cancer death in both men and women in 2005. Non-small cell carcinoma (NSCLC) occupies about 80% of lung cancers. Despite the attempt of a combination of surgery, chemotherapy, and radiation, its prognosis remains still poor. Thus, a lot of efforts have been put into to develop new, more effective treatments and biologic markers to predict the therapy responses. This lead to the discovery of various genetic changes, which are so-called "growth drivers" of NSCLC carcinogenesis, including EGFR, KRAS, BRAF, and EML4-ALK. These genetic mutations may become the new treatment targets, and there have been suggestions that different mutations are associated with different clinicopathologic characteristics and different prognosis. However, there have been few studies, either supporting or opposing, in Korean patients, about the genetic mutations of NSCLC, especially about those recently discovered mutations EML4-ALK. In this study, we aim to evaluate the status of the key "driver" mutations, especially " EML4-ALK " in Korean NSCLC patients and its association with the patient’s characteristics such as age, sex, smoking history, tumor stage, histological subtype, prognosis, and diagnostic methods. We expected to compile important genetic information of Korean patients, which may be different from that of foreign patients, and find predictive markers of the therapy targeting one or more of those mutations.
Methods: For a total of 482 non-small cell lung cancer specimens, ALK break-apart fluorescence in situ hybridization (FISH) study was performed in Guro Hospital of Korea University from 2012 to 2018. Clinicopathologic information was obtained from the pathology reports and medical records. Next generation sequencing(NGS) was performed on 10 formalin


fixed paraffin embedded (FFPE) tumor tissue using NGS platform with customized cancer panel. 5 lung adenocarcinoma cases with ALK gene fusion and 5 randomized adenocarcinoma cases without ALK gene fusion were used to observe and compare associated ALK mutations and The Cancer Genome Atlas (TCGA) lung adenocarcinoma transcriptome was analyzed to evaluate the status of the key "driver" mutations associated with EML4-ALK. Also Comparative analysis was performed using Kaplan-Meier curves on survival rate difference of the most widely used method for diagnosing gene mutations, the ALK FISH and IHC.
Results: ALK-rearranged tumors were significantly associated with younger age at presentation, more nodal metastasis, and higher stage (III, IV) of disease at diagnosis. Histomorphological features specific to ALK-rearranged tumors have been reported, including solid, acinar, cribriform formation, signet ring cell, micropapillary pattern, and the presence of papillary pattern. NGS, TCGA analysis didn't detect EGFR, KRAS, BRAF specific to ALK-rearranged. However, NGS detected new oncogene mutation 'TPM3-NTRK1 fusion', not to have been found in the previous study. In NGS study, diagnostic agreement was 90% between IHC and NGS, but 60% between FISH and NGS, 70% between FISH and IHC in ALK fusion. In EGFR mutation, Diagnostic agreement was 100% between PNA clamping and NGS. Kaplan-Meier survival analysis showed that ALK-positive lung cancer had a worse prognosis than ALK-negative with the mean survival of 30.172 months where both ALK FISH and ALK IHC were positive and the mean survival of 50.962 months where both were negative. However, the mean survival was 40.718 months in only ALK FISH positive, which was longer than only ALK IHC where the mean survival was 34.412 months. This manifest that ALK FISH is not superior to ALK IHC in the diagnosis of ALK gene mutation.
Conclusion: EML4-ALK fusion in non-small cell lung cancer exhibited distinct clinicopathologic and histomorphological features compared with other genotypes. Until recently, fluorescence in situ hybridization (FISH) has been established as the gold standard method for the detection of EML4-ALK fusion in lung adenocarcinoma. However in this study, Kaplan-Meier survival analysis showed that ALK FISH is not superior to ALK IHC in the diagnosis of ALK gene mutation. And it would be more efficient to use ALK FISH and ALK IHC together than only ALK FISH for the detection of EML4-ALK fusion. If more data is collected and studied through supplementation plan, NGS may overtake its place as a gold standard for ALK diagnosis.

목차 (Table of Contents)

• Abstract iv
• Abstract in Korean vii
• I. Introduction 1
• II . Materials and methods 6
• III . Result 11
• IV. Discussion 16
• V. References 23
• VI. Tables and figures 27