LAMMER kinase-Mediated Regulation of MBF Activity for Cell Cycle Progression in Fission Yeast

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Fission yeast LAMMER kinase Lkh1 is involved in control of the cell size and cell-cycle progression. Previous study revealed that Lkh1 interacts with Yox1, an inhibitor of MBF-complex for regulation of cell-cycle genes in G1/S progression and that Lkh1 may phosphorylate Thr40 and Thr41 on Yox1. In this study, in vitro kinase assay with wild type and mutant Yox1 proteins was performed to confirm Lkh1-mediated phosphorylation sites. In vitro kinase assay revealed that Yox1 wild type as well as point mutants were phosphorylated by Lkh1. This result suggests the existence of other Lkh1-dependent phosphorylation sites. Interestingly, the mobility of wild type and Yox1T40A mutant were slower than that of Yox1T41A and Yox1T40/41A. This result also suggests that Thr40 is not the amino acid residue for the Lkh1-dependent phosphorylation of Yox1, but Thr41 is. Functional analysis with yox1 mutant alleles suggested that phosphorylation of Thr40 and 41 on Yox1 was not involved in DNA-damage response and nitrogen starvation, but in flocculation and adhesive growth. To analyze the Lkh1-mediated cross talk between Rum1 and Yox1 in G1/S transition, quantitative PCR for MBF-dependent transcripts associated with Lkh1 was performed using rum1 and lkh1 deletion strains and the result shows that two genes involved cell-cycle progression were up-regulated both Δrum1 and Δlkh1. But the others involved DNA damage response were down-regulated.

국문 초록 (Abstract)

분열효모의 라머카이네이즈인 Lkh1은 세포주기와 세포길이를 조절한다. 선행연구결과, Lkh1이 세포주기 유전자의 전사조절을 담당하는 MBF의 음성 피드백 조절자인 Yox1과 관련이 있고, Yox1 단백질의 40번 째 와 41번 째 트레오닌을 인산화 시킴으로써 세포주기 중에서도 G1/S기에 관여할 것이라고 판단하였다. 본 실험에서는 Yox1 단백질의 40번 째 와 41번 째 트레오닌이 각각, 혹은 모두 알라닌으로 치환된 점돌연변이주를 제작하였고, 이를 이용한 인산화 분석을 통하여 Lkh1 단백질이 Yox1의 40번 째 와 41번 째 트레오닌을 인산화시키는 지에 대한 여부를 확인하였다. 그 결과, 모든 점돌연변주에서 Yox1 단백질의 인산화를 확인하였으나, 41번 째 트레오닌이 알라닌으로 치환된 Yox1 점돌연변이 단백질의 이동속도가 더 빠른 것으로 미루어보아, 41번 째 트레오닌이 인산화될 것으로 판단되었다. 또한 40번 째, 41번 째 이 외에도 다른 잔기를 인산화시킬 가능성이 있는 것으로 판단하였다. Lkh1에 의한 Yox1의 인산화가 미치는 생물학적 영향을 조사한 결과, 하이드록시유리아, 메틸메탄설포네이트와 같은 DNA 스트레스 유발원 및 질소영양 고갈 상태에 대한 민감성은 나타나지 않았다. 그러나, 세포 엉김현상과 세포 부착형 생장 표현형을 보였다. 이와 더불어, G1/S기에서 Rum1과 Yox1의 상호작용에 대하여Lkh1이 미치는 영향을 알아보기 위하여, Lkh1 의존성 MBF 관련 유전자를 대상으로 실시간 유전자증폭기법을 수행하였다. 그 결과, Lkh1 의존성 MBF 관련 유전자 중 세포주기 조절과 관련된 2개의 유전자가 rum1과 lkh1 각각의 결손 돌연변이주에서 발현량이 증가하였으나, DNA 스트레스와 관련된 2 개의 유전자는 발현량이 감소하였다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCATION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 5
• 1. Strains and primers 5
• 2. Media 5
• 3. Plasmid construction 9
• 4. Sensitivity test under several stresses 9
• 5. Flocculation test 9
• 6. Purification of GST fusion proteins 10
• 7. In vitro kinase assay 10
• 8. In vivo pull-down assay 10
• 9. Western blot 11
• 10. Quantitative PCR 11
• Ⅲ. Results & discussion 12
• 1. Relationship between Lkh1 and Yox1 12
• 2. Investigation of interaction between MBF components 12
• 3. Sensitivity under multiple stresses in pohspho-defective Yox1 mutant 17
• 4. Cell adhesion growth in Yox1T40/41 point mutant 17
• 5. Calcium-dependent flocculation of Yox1T40/41A point mutant 17
• 6. Analysis of transcripts for MBF-dependent genes in rum1 24
• IV. References 26
• ABSTRACT* 29
• 감사의 글 33