레트로바이러스벡터를 이용한 제대혈 세포에 유전자이입시 염화칼슘 농도와 싸이토카인의 효과 = Effects of Calcium Chloride Concentration and Cytokines on Retroviral-Mediated Gene Transfer into Umbilical Cord Blood Cells

국문 초록 (Abstract)

연구배경 : 혈액 세포에 레트로 바이러스를 이용한 유전자 이입시 이입 효율성이 낮은 것이 중요한 장애 요인이 된다. 이를 극복하기 polycation을 첨가해 왔다. 제대혈 단핵세포가 유전자 이입 표적세포로써 적절한지를 알아보고, polycation 첨가방법과 비교하여 유전자 이입시 레트로 바이러스 상층액에 싸이토카인과 염화 칼슘 농도가 유전자 이입에 미치는 영향을 살펴 보고자 하였다.
방법 : 레트로 바이러스 상층액에 일정량의 3가지 싸이토카인(IL-3, IL-6,SCF)과 4가지 종류의 염화 칼슘 농도를 달리하여 첨가한 후 제대혈 단핵세포에 유전자 이입을 하였다. 유전자 이입시킨 제대혈 단핵세포(2×106)를 4개씩 plating 한 후 이중 2개의 well에는 G418(1.0㎎/ml)를 첨가하여 G418 처리한 배지에서 형성된 집락수를 세었다. 동일한 실험을 3회 반복하였다.
결과 :
1) 싸이토카인을 사용하였을때 , IL-3 단독 사용시 보다는 IL-3, IL-6, SCF 혼합 사용시 유전자 이입 효율성이 4.1 배 6.8배 각각 증가되었다.
2) 간질 세포 존재 유무는 유전자 이입 효율성에 직접적인 영향을 주지는 않았다.
3)싸이토카인 첨가유무, 간질세포 조건에 상관없이 염화 칼슘 농도가 증가함에 따라 유전자 주입률이 3.6배 향상되었다.
4) 기존의 polybrene만 처리하였을때 보다 염화칼슘 농도를 올림으로써 유전자 이입에 사용되지 않고 버리는 레트로바이러스가 74%에서 29%로 감소 하였다.
5) 염화칼슘농도가 5mM 초과시에는 methylcellulose 배지에서 colony 수가 감소되었다.
6) G418 처리후 살아남은 colony는 PCR을 통해 Neo® 이 이입되었기 때문임을 확인할 수 있었다.
결론 : 싸이토카인 및 염화칼슘을 처리하여 유전자 이입 효율을 향상시킬수 있었고 생체 외에서 이러한 염화칼슘 침전법을 이용한 유전자 이입은 바닥에 붙어 자라는 세포(anchorage-dependent cell)를 대상으로 할때 더욱 효과적일 것으로 생각하며, 성공적인 유전자 치료에 필수적인 유전자 이입 효율성을 향상시키기 위해 더 많은 연구가 뒷받침 되어야 겠다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background : Low transduction efficiency has the main obstacle for retroviral mediated gene transfer into hematopoietic cells even with the addition of polycations to enhace transduction. We investigested the feasibility of mononuclear of CaCl₂ added to retroviral supernatant compared to the standard polybrene-enhanced transfection.
Methods : Cell free Neo^(R) retroviral supernatant containing 3 cytokines (Ⅱ-3, IL-6, SCF) with 4 different concentrations of CaCl₂ was added to target cells. After gene transfer, the cells(2×10^(6)/ml) were plated in qudriplicate, G418 was added to 2 wells of each set at 1.0 ㎎/ml, measured the percentage of G418 resistant progenitor derived colonies.
Results :
1) Use of cytokines or especially combined use of 3 cytokines (IL-3, IL-6, SCF)
together increased gene transfer efficiency to 6.8 times as compared to transductions in basal medium.
2) The presence of stromal supports during the transduction of the umbilical cord mononuclear cells did not increase gene transfection efficiency.
3) Transfection efficiency of CBMNCs (cord blood mononuclear cells) could be enhanced to 3.5 times by increment of CaCl₂.
4) Discarded retrovirus with standard polybrene-enhanced method could be reduced from 74% to 29% as the increase of CaCl₂ of the retroviral supernatant.
5) The number of colonies in methycellulose culture constantly reduced above 5mM CaCl₂.
6) Neo^(R) gene transfection in selected colony with G418 was confirmed by DNA-PCR.
Conclusion: We conclude that tranduction to umbilical cord blood progenitor cells could be enhanced to 6.8 or 3.6 times with the use of recombinant human growth factors(IL-3, IL-6, SCF) and the increment of CaCl₂ concentration added to retroviral supernatant, but it might be ctyotoxic above 5 mM. Where the use of the calcium coprecipitation method is contemplated in ex vivo gene therapy, anchorage-dependent target cells are more desirable.