Three-dimensional microenvironment induces efficient gene transduction through cell cycle regulation
저자
발행사항
Pocheon : CHA University, 2017
학위논문사항
Thesis(M.A.) -- Graduate School, CHA University Major in Biomedical Science, Department of Biomedical Science 2017
발행연도
2017
작성언어
영어
주제어
KDC
511 판사항(6)
DDC
612 판사항(23)
발행국(도시)
경기도
형태사항
viii, 37 leaves : illustrations (some color) ; 26 cm
일반주기명
Adviser: Soo-Hong Lee
Bibliography: leaves 32-35
소장기관
많은 연구자들이 세포의 기능을 향상시키거나 질병을 치료하기 위한 효율적인 유전자 전달 방법을 연구중이다. 그러나 인간 성체 줄기세포에서의 형질도입 효율은 매우 낮다. 그 중 레트로바이러스를 벡터로 사용하여 형질도입의 효율을 증가시키는 많은 연구가 진행되어 왔다. 형질도입의 유전자 전달 효율을 높이는 것은 매우 중요하며, 숙주 세포의 세포주기가 바이러스의 DNA integration 에 있어 매우 중요하다고 이미 알려져 있다. 그러므로, 일반적인 이차원적 세포 배양에서 세포주기를 조절하여 형질 도입 효율을 높이는 많은 연구가 진행되어 있다. 하지만, 삼차원적 환경에서 형질도입의 효율은 아직 알려지지 않았다. 본 연구에서, 우리는 인간 지방 유래 줄기세포를 삼차원적 환경인 하이드로젤에 encapsulation 하여 세포의 생존능, 세포 주기 상태, 형질도입 효율을 분석하였고 삼차원적 하이드로젤을 통해 조절한 세포주기에 따른 형질도입 효율과 전통적인 방법인 이차원적 세포 배양에서 조절한 세포 주기와 그에 따른 형질 도입 효율을 비교하였다. 이차원적 시스템에서, 세포주기는 serum starvation 과 serum refeeding 을 통해 조절하였다. 구체적으로, 18 시간 starvation 에서 세포주기의 G0/G1 기로 arrest 되었고, 20 시간의 serum refeeding 이 S 기 의 축적을 위한 최적의 조건이었다. 형질도입 효율은 세포주기를 조절하지 않은 인간 지방 유래 줄기세포 보다 유의적으로 높았다. 형질도입에서 삼차원적 encapsulation 의 효과를 알아보기 위해 인간 지방 유래 줄기세포를 히알루론산을 원료로 한 하이드로젤에 encapsulation 시킨 후 하이드로젤을 효소를 사용하여 녹여 세포만을 추출해 다시 배양 접시로 세포를 풀어 주어 세포주기를 조절하였다. 흥미로운 것은 삼차원적 하이드로젤에 encapsulation 한지 1 시간 만에 세포주기의 G0/G1 기로 arrest 되었고 배양 접시로 세포를 풀어준 후 12 시간 만에 S 기 의 증가를 관찰하였다. 유전자 형질도입 효율도 이차원적 세포주기 조절 방법과 비슷한 것을 관찰하였다. 우리는 삼차원적 환경을 통해 기존의 이차원적 방법보다 빠르게 세포주기를 조절할 수 있고, 기존의 이차원적 세포주기 조절 방법과 비슷한 유전자 형질도입 효율을 보였다는 것을 발견하였다. 삼차원적 환경의 세포는 기존의 이차원적 환경의 세포와는 형태적, 행동학적으로 다른 차이점을 가지고 있기 때문에 우리는 삼차원적 환경에서 빠른 G0/G1 기 arrest 가 세포의 형태학적 변화 때문이라고 예상하고 있다.
더보기Many researches have been conducted for the optimization of gene delivery to enhance cell function and to remedy diseases. However, gene transduction efficiency on human adult stem cell is very low. There are a number of studies to enhance retrovirus transduction efficiency. In the transduction, enhancing gene delivery rate to cell is important and it is well known that the host cell cycle plays an important role in the DNA integration. Therefore, a number of studies have been conducted to improve transduction efficiency by regulating cell cycle based on a 2D cell culture system. However, the effect of 3D microenvironment on transduction efficiency has remained unexplored. Here, we encapsulated human adipose derived stem cells (hASCs) in 3D hyaluronic acid based hydrogel, analyzed cell viability, cell cycle status, transduction efficiency, and compared the results with the 2D cell culture system. For 2D system experiment, cell cycle was regulated by serum starvation followed by refeeding with fetal bovine serum (FBS). Specifically, 18 h was needed to arrest cell cycle at G0/G1 phase, the accumulation of S phase was optimized by refeeding FBS for 20 h, and transduction efficiency was significantly improved compared to unregulated hASCs. To investigate the 3D encapsulation on gene transduction, hASCs were encapsulated in hyaluronic acid based hydrogels, released from hydrogel, and then infected with retrovirus. Interestingly, only 1 h of 3D encapsulation was sufficient to arrest cell cycle at G0/G1 phase, ratio of S phase cell cycle regulated hASCs was optimized at 12 h after release, and gene transduction efficiency was comparable to the cell cycle regulated hASCs in 2D system. Our findings suggest initial cell encapsulation in 3D environment improves gene transduction efficiency through faster cell cycle regulation. Based on the morphology and behavior changes of cells in 3D environment are different from 2D environment, we speculated the reason of initial G0/G1 arrest is changes of cell morphology through 3D environment.
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