Physiological Activities of Phenol Compound and Iridoid Glycoside Isolated from Pressurized Steam-Treated Corni Fructus

국문 초록 (Abstract)

본 연구에서는 가압상의 증숙 공정을 이용하여 전통적인 기존 증숙 공정과 비교함으로써 가압증숙 공정에 따른 산수유의 이화학적 품질특성 변화를 모니터링 하였고, 폐표피세포 보호효과에 대해 알아보기 위하여 인간유래 L132 세포주를 이용하여 과산화수소로 유도된 산화스트레스 모델에서 가압증숙 산수유 추출물의 세포사멸 억제효과를 확인하였다. 또한 가압증숙 산수유로부터 분리한 페놀화합물 (gallic acid), furan화합물 (5-hydroxymethylfurfural) 및 iridoid 배당체 (morroniside, loganic acid 및 loganin)의 HPLC chromatogram 특성을 확인한 다음, 각 화합물의 항산화활성, 미백효과, 주름개선효과, 조골세포 분화효과 및 파골세포 저해효과를 체계적으로 검증하고자 생리활성물질의 기능성을 확인하였다.

1. 가압증숙 산수유의 이화학적 품질특성
가압증숙 산수유의 제조는 수침한 산수유를 121℃, 1.2기압에서 각각 30분, 1시간, 2시간 및 3시간 동안 증숙하여 제조하였다. 가압증숙 산수유의 이화학적 품질특성을 확인한 결과, 페놀화합물은 gallic acid가 검출되었으며, iridoid 배당체는 morroniside, loganic acid 및 loganin이 검출됨을 확인하였다. 가압증숙 시간이 증가할수록 gallic acid와 5-hydroxymethylfurfural 함량이 증가하였으며, 특히 2시간동안 가압증숙한 산수유에서 높은 변화값을 나타내어 높은 생리활성을 나타낼 것으로 생각된다.

2. 가압증숙 산수유로부터 페놀화합물과 iridoid 배당체의 분리 및 항산화활성 탐색
가압증숙 산수유로부터 페놀화합물과 iridoid 배당체의 분리는 thin layer chromatography로 분리용매 (chloroform:methanol:formic acid=15:2:1, v/v)를 선정한 후, silica gel 60 open column chromatography를 이용하여 실시하였다. 총 페놀 함량 및 총 당 함량을 기준으로 F-1 (5-hydroxy-methylfurfural), F-2 (gallic acid 등), F-3 (morroniside), F-4 (loganin 등) 4 구간의 furan화합물, 페놀화합물 및 iridoid 배당체를 분리하였다. 각 분획물은 HPLC retention time, 용출순서 및 최대흡수파장과 같은 분광 특성에 의해 확인하였으며, 표준물질과 비교분석하였다. 항산화 활성은 gallic acid가 함유된 F-2에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 인간유래 폐표피세포인 L132 세포주를 이용하여 과산화수소로 유도된 산화스트레스 모델에서는 morroniside 및 loganin을 함유한 F-3과 F-4에서 높은 세포사멸 억제효과를 나타냄을 확인하였다.

3. 가압증숙 산수유로부터 분리한 페놀화합물과 iridoid 배당체의 항노화 활성
가압증숙 산수유로부터 분리한 페놀화합물과 iridoid 배당체의 생리활성 평가는 항노화를 목적으로 각 분획 특성에 따라 B16F10 세포주를 이용한 F-1의 피부미백 효과, HS68 세포주를 이용한 F-2의 피부주름개선 효과, MC3T3-E1 세포주를 이용한 F-3 및 F-4의 기간별 조골세포 분화 효과 및 RANKL로 분화유도된 RAW264.7 세포주를 이용한 F-3 및 F-4의 파골세포 분화억제 효과를 확인하여 향후 각 분획물을 이용한 항노화 화장품 소재 및 기능성식품 소재로의 활용 가능성을 확인하였다. 따라서 가압증숙 산수유로부터 분리한 분획물은 각종 질병이나 노화, 흡연, 스트레스를 겪는 소비자들을 대상으로 한 피부미백, 피부주름개선 및 골형성과 골흡수의 항상성 유지 효과를 가지는 항노화 화장품 소재 및 기능성식품 소재로 활용이 가능하다 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 6
• A. Isolation of bioactive compounds from pressurized steam-treated Corni Fructus
• 1. Plant material 6
• 2. Preparation and extraction 6
• 3. Isolation of bioactive compounds 8
• 3-1. Thin layer chromatography (TLC) 8
• 3-2. Silica gel 60 open column chromatography 8
• B. Physicochemical properties of pressurized steam-treated Corni Fructus
• 1. Color value 9
• 2. Extraction yield 9
• 3. Total sugar content 9
• 4. Reducing sugar content 10
• 5. Total phenol content 10
• C. High performance liquid chromatography (HPLC) analysis of pressurized steam-treated Corni Fructus
• 1. Organic acid composition 11
• 2. Free sugar composition 11
• 3. Bioactive compounds composition 11
• D. Anti-oxidant activities of pressurized steam-treated Corni Fructus
• 1. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) value 12
• 2. 2,2-diphenyl-1-pycrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity 13
• 3. 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) radical scavenging activity 13
• 4. Superoxide radical scavenging activity 14
• 5. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) 14
• 6. Reducing power 14
• E. Physiological activities of pressurized steam-treated Corni Fructus
• 1. Cell viability 15
• 2. Protection against H2O2-induced effects on L132 cells 15
• 2-1. Cell culture 15
• 2-2. Protective effect against H2O2-induced cytotoxicity 16
• 3. Protective effects against α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)-induction of B16F10 cells 16
• 3-1. Cell culture 16
• 3-2. Sample treatment 17
• 3-3. Cellular melanin content 17
• 3-4. Cellular tyrosinase activity 17
• 3-5. RT-PCR analysis of mRNA expression 18
• 4. Protective effects against UVB-induction of HS68 cells 19
• 4-1. Cell culture 19
• 4-2. Ultraviolet irradiation and sample treatment 19
• 4-3. Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) protein levels 19
• 4-4. Procollagen Type I C-peptide (PIP) biosynthesis release 20
• 4-5. RT-PCR analysis of mRNA expression 20
• 5. Proliferation and differentiation effects on MC3T3-E1 osteoblast cells 21
• 5-1. Cell culture 21
• 5-2. Cell differentiation and sample treatment 21
• 5-3. Cellular alkaline phosphatase (ALP) activity 21
• 5-4. Cell matrix ALP staining 22
• 5-5. Alizarin red S staining 22
• 5-6. von Kossa staining 23
• 5-7. RT-PCR analysis of mRNA expression 23
• 6. Effects against RANKL-induction differentiation of RAW264.7 osteoclast cells 24
• 6-1. Cell culture 24
• 6-2. Cell differentiation and sample treatment 24
• 6-3. Cellular tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity 25
• 6-4. Cell matrix TRAP staining 25
• F. Statistical analysis 25
• Ⅲ. RESULTS AND DISCUSSION 26
• A. Physicochemical properties and physiological activities of pressurized steam-treated Corni Fructus (PSC)
• 1. Physicochemical properties of PSC 26
• 1-1. Change in color value and observations 26
• 1-2. Change in yield, total sugar, reducing sugar, and total phenol content 29
• 2. High performance liquid chromatography (HPLC) analysis of PSC 31
• 2-1. Change in organic acid composition 31
• 2-2. Change in free sugar and bioactive compound compositions 33
• 3. Protective effect of PSC against H2O2-induced cytotoxicity of L132 cells 38
• 4. Osteoblast differentiation and osteoclast formation effects of PSC on MC3T3-E1 osteoblast cells and RANKL-induced RAW264.7 osteoclast cells 41
• 4-1. Cell proliferation 41
• 4-2. Alkaline phosphatase (ALP) activity and staining 43
• 4-3. Alizarin red S staining and von Kossa staining 45
• 4-4. Cytotoxicity and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity and staining 47
• B. Isolation and identification of bioactive compounds from pressurized steam-treated Corni Fructus (PSC)
• 1. Silica gel 60 open column chromatography 51
• 1-1. Isolation of bioactive compound fractions 51
• 1-2. Identification of bioactive compound fractions 53
• 2. Anti-oxidant effects of bioactive compound fractions 60
• 3. Protective effect of bioactive compound fractions against H2O2-induced cytotoxicity of L132 cells 64
• C. Physiological activities of bioactive compound fractions isolated from pressurized steam-treated Corni Fructus (PSC)
• 1. Skin whitening effects of furan compound fraction (F-1) isolated from PSC on B16F10 cells 66
• 1-1. Cytotoxicity and protective effects against α-MSH-induction 66
• 1-2. RT-PCR analysis of mRNA expression 71
• 2. Anti-wrinkle effects of phenol compound fraction (F-2) isolated from PSC on HS68 cell 73
• 2-1. Cytotoxicity and protective effects against UVB-induced 73
• 2-2. RT-PCR analysis of mRNA expression 77
• 3. Osteoblast differentiation and osteoclast formation effects of iridoid glycoside compound fractions (F-3 and F-4) isolated from PSC on MC3T3-E1 osteoblast cell and RANKL-induced RAW264.7 osteoclast cell 80
• 3-1. Cell proliferation 80
• 3-2. Alkaline phosphatase (ALP) activity and staining 82
• 3-3. Alizarin red S staining and von Kossa staining 84
• 3-4. RT-PCR analysis of mRNA expression 86
• 3-5. Cytotoxicity and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity and staining 89
• Ⅳ. SUMMARY 93
• Ⅴ. REFERENCES 96