Cardioprotective effect of survivin in doxorubicin-induced myocardial injury model
저자
발행사항
Seoul : Graduate School, Yonsei University, 2015
학위논문사항
학위논문(박사)-- Graduate School, Yonsei University : Graduate Program in Science for Aging Molecular Biology 2015. 8
발행연도
2015
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
서울
기타서명
독소루비신으로 유도된 심근 손상모델에서 서바이빈 단백질의 심근 보호효과 규명
형태사항
xi, 104장 : 삽화(일부천연색) ; 26 cm
일반주기명
지도교수: Seok-Min Kang
소장기관
세포사멸은 독소루비신에 의해 발생한 심장독성에서 중요한 메커니즘으로 알려져 있다. 세포사멸을 억제하는 단백질 중 하나인 서바이빈은 심근세포의 분자적 경로에 따른 세포사멸의 조절에 관련이 있다. 최근 연구에 따르면 동물 모델에서 서바이빈 단백질 발현 감소는 비정상적 심장 리모델링 발생과 연관 있는 것으로 보고되었다. 그러나 독소루비신에 의한 심근손상에서 서바이빈 단백질의 심근보호효과에 대한 기전 연구는 진행되지 않았다. 따라서 본 연구는 독소루비신에 의한 심근손상 모델에서 서바이빈 단백질의 역할과 서바이빈 단백질을 단백질 전달시스템을 사용하여 세포사멸 억제효과와 그에 따른 분자 생물학적 기전을 조사하였다.
본 연구에서 심근세포와 쥐의 심장에서 독소루비신을 처리한 결과 서바이빈 단백질이 유의하게 감소하는 것을 관찰하였다. 또한, Sp1 단백질은 서바이빈 유전자 발현을 유도하는 역할을 하며, 프로테아좀 활성화가 독소루비신에 의해 증가하여 Sp1 단백질의 분해가 되는 것을 확인하였다. p53 단백질의 활성화는 서바이빈 유전자의 전사를 억제하며, 독소루비신에 의해 p53의 인산화와 단백질이 증가하는 것을 관찰하였다. 독소루비신에 의해 심근세포에서 서바이빈 전사에 관여하는 프로모터에 Sp1 단백질이 붙는 수준은 감소하였지만 p53 단백질은 붙는 수준이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, Sp1 단백질을 조절하는 상위단백질은 Akt, mTOR, p70s6k 단백질이며, 이들은 독소루비신에 의해 활성화가 감소하는 것을 관찰하였다.
서바이빈 단백질의 세포 보호 효과를 규명하기 위해 서바이빈 유전자를 HIV 바이러스에서 얻은 단백질 전달시스템인 TAT-유전자와 결합한 단백질을 제작하여 사용하였다. TAT-서바이빈 단백질은 심근세포와 쥐의 심장에 효과적으로 전달되는 것을 관찰 할 수 있었으며, caspase-3 activity, TUNEL assay 그리고 cell viability 방법을 통해 전달된 TAT-서바이빈 단백질의 세포사멸 억제 효과를 확인하였다. 또한, TAT-서바이빈 단백질은 독소루비신에 의해 유도된 심근세포의 공포 형성과 근원섬유의 손상이 억제되는 것을 관찰하였다.
TAT-서바이빈 단백질의 심장 기능 회복 효과를 알아보기 위해 랑겐도르프 시스템을 이용하였다. 허혈-재관류 손상 후 좌심실내압 (LVDP: left ventricular developed pressure)와 RPP (Rate pressure product)를 관찰한 결과, TAT-서바이빈 단백질 투여가 심장기능 회복에 관여하는 것을 관찰할 수 있었다.
또한, 심근세포를 이용한 독소루비신 세포 손상 모델에서 TAT-서바이빈 단백질이 p38 MAPK 단백질의 활성화를 억제하여 Bcl-2의 전사인자인 CREB 단백질이 핵으로 이동되었고, 세포사멸 과정 중 미토콘드리아에서 분비하는 Smac 단백질이 Bcl-2 단백질 발현에 의해 분비가 억제 되는 것을 확인되었다.
본 연구 결과를 통해, 서바이빈 단백질은 독소루비신의 심근 손상 유발에 있어 중요한 단백질임을 알 수 있었고, 향후 임상에서 심근보호 치료약제의 개발에 중요한 타겟으로 사용 될 수 있을 것이다.
핵심 되는 말: 세포사멸, 서바이빈 단백질, TAT 단백질, 독소루비신, 심근세포
Apoptosis has been known to be an important mechanism of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Survivin, belongs to the inhibitor of apoptosis protein (IAP) family is associated with apoptosis and alteration of cardiomyocyte molecular pathways. Recent studies have shown that reduction of survivin expression is associated with less favorable cardiac remodeling in animal models. However, the mechanism by which survivin mediates the cardioprotective effect against doxorubicin-associated injury has not been fully determined. Therefore, we investigated the anti-apoptotic effect and molecular cellular mechanisms of survivin using a protein delivery system in doxorubicin-induced cardiomyocyte injury model.
We demonstrated that treatment of doxorubicin resulted in a significant decrease of survivin expression in the H9c2 cardiomyocyte cell line and Sprague Dawley rat hearts. In addition, Sp1 play a role in the upregulation of survivin expression, doxorubicin treatment increases a degradation of Sp1 protein via proteasome-mediated proteolysis. Transcription of survivin decreases by activation of p53. The effect of doxorubicin is consistent with the observed increase p53 protein level and the phosphorylation level at Ser15 in the cardiomyocyte. Following doxorubicin treatment of the cardiomyocyte, the survivin promoter has reduced levels of bound Sp1, but an increased level of bound p53. Moreover, the upstream signaling Sp1 protein, such as Akt, mTOR and p70s6k, were also decreased by doxorubicin treatment.
We constructed a recombinant survivin fused to the protein transduction domain (PTD) derived from HIV-TAT protein. And, Purified recombinant TAT-survivin protein were efficiently delivered to H9c2 cardiomyocyte cell line and Sprague Dawley rat hearts via intraperitoneal injection, and its transduction showed an anti-apoptotic effect, demonstrated by reduced caspase-3 activity, and apoptotic index concomitantly with increased cell viability against doxorubicin-associated injury. Moreover, TAT-Survivin protein-pretreated hearts demonstrated decreased less cardiomyocyte vacuolation and myofibrillar disarray, compared with doxorubicin-associated injury hearts.
We evaluated the effect of TAT-survivin protein on cardiac functional recovery using Langendorff system. After ischemia-reperfusion injury, cardioprotective effect of TAT-survivin such as functional recovery measured by LVDP (left ventricular developed pressure) and RPP (rate pressure product) was observed.
Furthermore, the survivin pretreatment using PTD-mediated delivery has a potential cardioprotective effect against doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis through the mechanism involving a decrease in the phosphorylation of p38 MAP kinase, mitochondrial Smac release, and increased expression of Bcl2 and activated nuclear translocation of CREB.
Present study suggest that firstly, survivin may be an important protein in the process of doxorubicin-induced cardiomyocyte injury, and secondly, TAT-survivin protein has a potentially protective effect against doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis. Taken together, these results may provide the insight for future development of drugs targeted on myocardial protection under cardiovascular diseases.
Key Words: Apoptosis; Survivin; TAT-HIV; Doxorubicin; Cardiomyocyte
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