FACS-seq as a Powerful Tool for Profiling the Dose-response Curves of Biosensors in a Massively Parallel Manner
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2021
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42-42(1쪽)
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Living organisms have a variety of mechanisms to sense and respond to the environmental signals by dynamically regulating their genetic expression networks. Harnessing this ability, genetically encoded biosensors, mimicking natural regulation networks by assembling basic biological parts like promoter, ribosome binding site, operator, reporter etc. into genetic circuit, are developed to recognize the analytes and transduce their signals to a measurable output. Dose-response curve, mapping the genetic circuits to their function, shapes how individual biosensors respond to the specific signals, which is crucial not only for the specific usage scenario of genetic encoded biosensor, but also for illustrating their regulatory functions in living cells. In this report, we would like show our recent attempts on the application of a dose-response profiling method, namely fluorescence-activated cell sorting coupled with next-generation sequencing (FACS-seq), in generating accurate dose-response curves for thousands of biosensors in a massively parallel manner, which provides a powerful platform for dissecting the mechanistic basis of the regulatory elements in living cells, and for the fine tuning of biosensors in a customized and low-cost manner.
As the first example, we focused on tnaC, which encodes the tryptophan operon leader peptide in bacteria and is a model of macromolecular-machinery-dynamics-dependent regulatory elements. Working as a molecular sensor, tnaC responds to intracellular tryptophan (Trp) and regulates the biosynthesis of indol. We used FACS-seq to generate accurate response curves for all possible codon substitutions in tnaC. The FACS-seq results allowed us to generate comprehensive genotype-phenotype maps for 1,450 tnaC variants in living cells. The results clarified the nature of several transient, previously enigmatic states involving RNAP and the ribosome, and these states play important roles in the tnaC sensor response. Using in silico modeling and additional experiment, we further demonstrated the molecular basis of the quantitative relation between basal and inductive response, as well as the range of detection of the sensor.
In the second example, we developed a novel biological parts assembly workflow to encode genetic circuits with short DNA barcodes, which make sure one-to-one correspondence of the barcodes and biological parts combinations, enabling high-throughput generation of dose-response curves of higher-order combinatorial biosensor space. As a proof of concept, we applied our novel workflow for the fine-tuning of the dose-response curve of malonyl-CoA biosensor based on FapR-fapO system in Saccharomyces cerevisiae. With our 5-step encoding workflow, a trackable combinatorial library contained 5155/5184 combinations with 6 levels of TF dosage, 4 different operator positions, and 216 possible UAS designs, was constructed. FACS-seq successfully characterized the response curve of 2,632 biosensors out of 5184 combinations, providing large-scale genotype-phenotype association data of the designed biosensors. Machine-learning algorithms were then developed to predict uncharacterized dose-response curves and identify key features in the whole combinatorial library, generating a panoramic scanning map of the combinatorial space. With the assistance of our novel workflow, 3755 dose-response curves were obtained at a cost of $1.37 per curve, and a malonyl-CoA biosensor with the largest dynamic response range reported so far was successfully acquired.
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