SVC 진단을 위한 Dual probe 기반의 quantitative RT-PCR 방법 개발 및 유효성 평가 = Development and validation of dual probe-based quantitative RT-PCR for diagnosis of Spring Viremia of Carp
저자
발행사항
아산 : 선문대학교 일반 대학원, 2024
학위논문사항
학위논문(석사)-- 선문대학교 일반 대학원 : 응용생물과학과 응용생물과학과 수산생명의학과 2024. 2
발행연도
2024
작성언어
한국어
주제어
발행국(도시)
충청남도
형태사항
58 ; 26 cm
일반주기명
지도교수: 권세련
UCI식별코드
I804:44008-200000736499
소장기관
Spring Viremia of Carp (SVC) primarily infects carp and causes high mortality, followed by significant economic losses in the carp farms. There is currently no effective vaccine or medication for this disease. The World Organization for Animal Health (WOAH) currently recommends the semi-nested RT-PCR method as a molecular biology diagnostic technique for SVC. However, this method needs a considerable amount of time and has low sensitivity. In this study, we developed a quantitative RT-PCR method for simultaneously detecting two different sequences (matrix and nucleocapsid genes) of spring viremia of carp virus (SVCV) and designated by a dual probe quantitative RT-PCR (dual probe qRT-PCR). For the validation of the dual probe qRT-PCR, the analytical sensitivity, analytical specificity, diagnostic sensitivity, diagnostic specificity, and reproducibility were assessed. From results of the analytical sensitivity of dual probe qRT-PCR, it was determined that new methods have 6.2 copies of a 95% limit of detection (LoD95%) using the SVCV positive control. No cross-reaction was found against two Rhabdoviruses (viral hemorrhagic septicemia virus and infectious hematopoietic necrosis virus) and two carp pathogens (koi herpesvirus disease and carp edemavirus) and five fish cell lines (epithelioma papulosum cyprini, fathead minnow, bluegill fry, rainbow trout gonad, and koi fin). Diagnostic performance was evaluated using 550 defined carp samples. Compared to the conventional RT-PCR, the diagnostic sensitivity (Dse) and specificity (Dsp) of dual probe qRT-PCR were found be 100% (95% confidence interval (CI): 97.5~100%) and 100% (95% CI: 99.05~100%). Using 266 undefined carp samples, the Dse and Dsp of dual probe qRT-PCR were compared to the conventional RT-PCR. The results showed that Dse and Dsp were 100% (95% CI: 94.73~100%) and 54.5 (95% CI: 47.6~61.41%). In order to confirm the reproducibility, inter- and intra-assay repeatability were performed using two SVC-positive and two SVC-negative samples. Two instructors conducted dual probe qRT-PCR three times a day for three days. There were no significant differences in the results. Furthermore, the unknown sample analysis of 50 carp samples carried out by two laboratories showed no significant difference in the results. From these results, it was confirmed that the dual probe qRT-PCR is a promising method for SVC diagnosis with high sensitivity and specificity. Therefore, it could be useful to detect SVCV in quarantine, surveillance, and monitoring.
SVC 진단을 위한 Dual probe 기반의 quantitative RT-PCR 방법 개발 및 유효성 평가 김지수 응용생물과학과, 수산생명의학 선문대학교 일반대학원 잉어봄바이러스(Spring viremia of carp, SVC)는 봄철에 주로 발생하며, 비단잉어에 감염되어 높은 유병률과 사망률을 유발한다. 바이러스가 발생 하면 전염성이 강하여 비단잉어 양식장에 경제적 피해를 입힌다. 이 바이 러스에 대한 효과적인 백신이나 약물은 없으며 바이러스의 확산을 막고 피 해를 방지해야 한다. 현재 World Organization for Animal Health (WOAH) 에서는 분자생물학적 진단법으로 nested RT-PCR 방법을 권장하고 있다. 이 방법은 conventional RT-PCR 방법을 수행한 후 nested PCR까지 수행 하게 되어 있어 여러가지 진단법이 서술되어 있지만, 숙련된 기술자가 필 요하며 많은 시간이 소요된다. 또한, 전 세계적으로 SVCV의 확산을 방지 하려면 빠르고 정확하고 민감하게 탐지하는 방법을 개발하는 것이 중요하 다. 본 연구에서는 SVCV의 두가지 서로 다른 서열 (matrix protein, nucleocapsid protein)을 동시에 검출하는 quantitative RT-PCR 방법을 개 발하고 이 진단법이 유효성을 검증(validation)하였다. Validation을 위해 분 석 민감도(analytical sensitivity), 분석 특이도(analytical specificity), 진단 민감도(diagnostic sensitivity), 진단 특이도(diagnostic specificity) 및 재 현성을 평가하였다. Dual probe qRT-PCR을 사용한 quantitative PCR의 검 출 한계와 다른 바이러스를 이용한 특이성을 분석하였으며, conventional RT-PCR 분석법과 진단 특이성과 민감도를 비교하고 재현성 평가를 진행 하였다. Dual probe qRT-PCR을 사용한 qRT-PCR의 분석 민감도는 95% 검출 한계(LoD95%)로 검증하였으며, SVCV positive control의 6.2 copies이다. 또 한, SVCV positive control (2x107 copies/µL)을 10배 연속 희석하여 standard curve를 구축하였다. SVCV와 같은 Rhabdoviridae과에 속하는 2가지의 viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV), infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) 의 바이러스 상층액과 잉어의 주요 질병인 koi herpesvirus disease (KHV), carp edemavirus disease (CEV)에 감염된 비단잉어의 조직의 핵산을 추출 하여 dual probe qRT-PCR를 사용해 qRT-PCR을 실시한 결과, 교차 반응 이 발견되지 않았다. 또한, SVCV에 감수성이 있는 어류 세포인 Epithelioma papulosum cyprini (EPC), Fathead Minnow (FHM), Bluegill fry (BF-2), Rainbow trout gonad (RTG-2) 그리고 Koi fin (KF-1)를 사용 한 실험에서 비특이적 증폭이 없었다. SVCV에 감염된 비단잉어와 감염되지 않은 비단잉어, SVCV가 감염되지 않은 비단잉어와 임의로 감염시킨 비단잉어를 무작위로 섞어서 감염 정보 를 알 수 없는 비단잉어 시료를 총 950마리를 이용하여 dual probe qRT- PCR를 사용한 qRT-PCR과 conventional RT-PCR의 분석 결과로 진단 성 능을 평가하였다. 재현성을 확인하기 위해 동일한 실험실의 두 명의 연구자가 SVCV에 감염된 비단잉어 조직 시료 2개와 SVCV 음성 조직 시료 2개를 3일 동안 3회 동일하게 사용하고, 2곳의 실험실에서 비단잉어 시료 50개(SVCV positive 30개, SVCV negative 20개)로 dual probe qRT-PCR을 이용한 qRT-PCR을 분석한 결과, 높은 재현성을 보였다, 본 연구 결과에서는 새로 개발된 dual probe qRT-PCR을 사용한 분석 법은 SVCV의 감염 유무를 확인할 수 있는 유용한 방법이라고 사료되며, 질병을 조기에 진단하여 초기 확산을 막고 피해 방지를 위한 방법으로 활 용 가능성을 기대할 수 있다.
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