Study on target specific genome editing using CRISPR system : Development of the target specific genome editing method by engineering of CRISPR Cas12a system = CRISPR 시스템을 이용한 표적 특이적 유전체 편집 연구 : CRISPR-Cas12a 시스템 엔지니어링을 통한 표적 특이적 유전체 편집 방법 개발
저자
발행사항
서울 : 건국대학교 대학원, 2022
학위논문사항
학위논문(석사)-- 건국대학교 대학원 : 생명공학과 2022. 2
발행연도
2022
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
서울
형태사항
72 ; 26 cm
일반주기명
지도교수: 전봉현
UCI식별코드
I804:11004-200000588953
소장기관
The CRISPR–Cas complex system is used for a wide range of target-specific genome editing. One of the CRISPR effector proteins, CRISPR–Cas12a (Cpf1), controls target genes by recognizing protospacers rich in Thymine (T) protospacer adjacent motif (PAM) sequences.
Previous report shows that Cas12a has a higher sensitivity to guide RNA mismatch than Cas9 does. Therefore, the chance of the off-target sequence recognition and cleavage is low for present Cas12a system. However, off-target cleavage efficiency can be more problematic when improving Cas12a cleavage efficiency for therapeutic purposes, as the Cas12a system allows for mismatches in regions distant from the PAM sequence (TTN or TTTN) of the protospacer. Therefore, off-target cleavage by Cas12a was investigated in detail and the off-target cleavage problem was addressed by modifying the Cas12a (cr) RNA.
I developed chimeric (cr) RNA guided CRISPR-Cas12a system, which can induce mutations in the target DNA sequence in a very specific and effective manner by changing the energy potential of the base pair with the target DNA by partially replacing (cr) RNA with DNA.
A model has been proposed to describe how chimeric (cr) RNA guided CRISPR-Cas12a system effectively induces mutations on the genome of human derived cell lines. chimeric (cr) RNA guided CRISPR-Cas12a based genome editing dramatically reduces off-target cleavage and consequently increases safety, which has the potential for therapeutic application in human body for refractory diseases caused by genetic mutations.
CRISPR–Cas 시스템은 표적 특이성 유전체 공학에 널리 사용됩니다. CRISPR-Cas12a (Cpf1)는 티민 프로토 스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열이 풍부한 프로토 스페이서를 인식하여 표적 유전자를 제어하는 CRISPR 이펙터 단백질 중 하나입니다.
Cas12a는 Cas9보다 RNA 불일치를 유도하는 민감도가 높습니다. 따라서, Cas12a은 off-target 인식 및 절단이 Cas9의 비해 더 낮게 일어납니다. 그러나 프로토 스페이서 중 PAM 서열 (TTTN 또는 TTN)에서 멀리 떨어진 영역에서는 불일치를 허용하기 떄문에, 치료 목적으로 Cas12a 활성이 활용 될 때 표적 외 절단 문제를 일으킬 수 있습니다. 따라서 Cas12a에 의한 비 표적 절단을 조사하고 Cas12a - (cr)RNA를 수정하여 비표적 절단 문제를 해결했습니다.
우리는 (cr) RNA를 DNA로 부분적으로 대체하여 염기쌍의 에너지 포텐셜을 표적 DNA로 변화시켜 매우 효과적인 방식으로 표적 DNA 서열의 돌연변이를 유도 할 수있는 CRISPR-Cas12a를 개발했습니다.
그리고 키메라 (cr) RNA가 CRISPR-Cas12a 세포의 유전자에서 어떻게 효과적으로 작동 하는지 설명하는 모델을 제안하였습니다. 키메라 가이드 기반 CRISPR-Cas12a 유전자 편집은 비 표적 절단을 감소시키는 결과를 보여주었으며, 결과적으로 안전성을 증가시켜 유전적 돌연변이로 인한 불응성 질환에 치료 적용 가능성을 보여주었습니다
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