Development of mRNA cap substitute
저자
발행사항
서울 : 고려대학교 대학원, 2022
학위논문사항
학위논문(석사)-- 고려대학교 대학원 : 생명과학과 분자생물학 2022. 8
발행연도
2022
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
서울
형태사항
50 p ; 26 cm
일반주기명
지도교수: 김윤기
UCI식별코드
I804:11009-000000268885
DOI식별코드
소장기관
Messinger ribonucleoproteins (mRNP) are synthesized by multiple steps in cell. First, pre-mRNA is transcripted by RNA polymerase using DNA as a template. Afterward, newly synthesized pre-mRNAs undergo three major processing steps: attachment of a 7-methylguanosine cap to the 5′ end(5′ capping); exon ligation and intron removal(splicing); and forming 3′ end of pre-mRNA through cleavage followed by addition of non-templated poly A tail(3′ polyadenylation) (1). After processing, mature mRNAs packaged into mRNPs by mRNA binding proteins in the nucleus. After entire processing in the nucleus, mRNPs are exported to the cytoplasm go through the nuclear pore complex (2).
5′ capping is the first pre-mRNA processing step. It occurs after about 20-30 nucleotides of pre-mRNA have been transcripted (3). N7-methylated guanosine associate with the first nucleotide of the mRNA by a reverse 5′ to 5′ tribhosphate linkage. The cap structure have multiple functions throughout the life cycle of mRNA. It can help mRNA translation through binding with Cap binding proteins like CBC or eIF4E (4). 5′ cap also act as shield of mRNAs from degradation by exonucleases and upregulates transcription, polyadenylation, splicing, and nuclear export of mRNA (5). Removal of the 5′ cap is critical for mRNA stability. The decapping reaction is catalysed by decapping Dcp1/2 complex (6). Decapping complex leaves 5′ monophosphate on mRNA and it is target of Xrn1 exonuclease (7).
Lariat capping ribozyme(LCRz) can make alternative cap structure. LCrz cleaves itself at an internal processing site (IPS) and leave the fragment of RNA with a three nucleotide 5′ lariat cap. The first and the third nucleotide of lariat cap are linked by a 2′ to 5′ phosphodiester bond (8, 9). Lariat cap is not substrate of decapping enzyme. So, lariat-capped mRNA can be stable then normal 5′ capped mRNA.
In this study, I confirm that Lariat cap can be used as a substitute for conventional 5′ N7-methylated guanosine cap. Lariat capped mRNA can be made through in vitro transcription of lariat capping ribozyme and its self-cleavage activity. Lariat capped mRNA is more stable than conventional 5′ N7-methylated guanosine capped mRNA. Lariat capped mRNA can be translated by internal ribosome entry site(IRES).
Lariat capping ribozyme (LCRz)는 RNA의 5' 말단을 편집하는 천연 Ribozyme이다. LCRz는 splicing과 유사한 방식으로 2'-5' 인산디에스테르 결합을 가진 3nt lariat cap을 형성한다. N7-메틸화 구아노신(m7G) cap은 주요 역할인 번역 상향 조절부터 전사, 3' 폴리아데닐레이션, 스플라이싱 및 cytoplasm으로의 이동까지 mRNA에 다양한 역할을 하며 mRNA의 5' 말단을 형성한다. Lariat cap은 이런 다양한 역할을 하지는 못하지만 mRNA의 5' 말단을 형성할 수 있다. Lariat cap에 의한 5' 말단은 decapping enzyme에 의해 부서지지 않아서 m7G cap보다 더 안정적이다.
본 연구에선 LCRz에 의해 만들어진 lariat cap이 mRNA의 cap 대체제가 될 수 있는지 확인하였다. Lariat capped mRNA가 in vitro 전사를 통하여 형성될 수 있음을 확인하였으며, m7G mRNA와의 비교를 통하여 m7G cap보다 lariat cap이 더 안정적인 것을 확인하였다. 또한 lariat capped mRNA 세포 내 lariat RNA를 target으로 하는 lariat debranching enzyme DBR1의 target이 아닌 것을 in vitro debranching assay를 통하여 확인하였다. 또한 lariat capped mRNA가 내부 번역 개시를 통해 번역될 수 있음을 internal ribsome entry site (IRES)를 통하여 확인하였다. 이러한 모든 특성을 종합하여, mRNA cap 대체제로써 LCRz가 만든 lariat cap의 가능성을 확인하였다.
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