보리 lipid transfer protein 유전자 (blt101)의 발현양상과 내동성 관련 작용기작
저자
발행사항
용인: 단국대학교 대학원, 2009
학위논문사항
학위논문(박사)-- 단국대학교 대학원 : 생명자원과학과 식량생명공학전공 2009. 8
발행연도
2009
작성언어
영어
주제어
DDC
631.53 판사항(22)
발행국(도시)
경기도
기타서명
Molecular analysis of Barley Lipid Transfer Protein gene (blt101) and its role in cold tolerance
형태사항
vii,96 장: 삽도; 26cm.
일반주기명
단국대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
지도교수:황철호
참고문헌 : 80-88장.
소장기관
A cDNA clone of low-temperature-induced blt101 (barley lipid transfer protein 101) was isolated by PCR using a cDNA synthesized from barley leaves grown under low-temperature (10℃ day / 4℃ night) for 4 days. It has been known that the blt101 mRNA is induced specifically in response to low temperature and accumulates to a high level in barley crown tissues. Also, it appears that Blt101 may have a protective role in maintaining plasma membrane function during cold acclimation in barley. But the exact function is still not clear.
In our results, the highest level of Blt101 transcript was induced in leaves, crown region and roots in all of four barley cultivars (two spring barley, two winter barley) undergone a low (10 °C, 8hr day / 4 °C, 16hr night) temperature treatment for 1 day or 2 days. The transcriptions in long term cold acclimation were differed among the four cultivars in crown and root while those were not in short term cold acclimation. The differential expressions in transcriptional levels were correlated with that from protein level. These results indicate that amount of Blt101 expression is correlated with degrees of cold tolerance for barley and Blt101 has a role related with cold tolerance.
To confirm localization of Blt101, western analyses using protein fractions with insoluble proteins, soluble proteins and apo-protein showed that Blt101 was accumulated in extracellular space under the cold condition. However, Transient expression analysis of the Blt101 fused to GFP also showed that Blt101 was localized into plasma membrane in wheat leaf and onion epidermal cell. In order to know a function of the blt101, transformation of wheat (cv: Bobwhite) was performed by bombardment with immature embryos. Four Blt101 over-expressing transgenic wheat lines were obtained and those plants grew slower than non-transgenic wheat in seedling stage. The contents of chlorophylls in transgenic wheat lines were higher than non-transgenic during cold acclimation. The slower growths and higher contents of chlorophylls in transgenic wheat lines were expected that the results due to low transcription of endogenous genes induced by hormones related with growth of plant. In sustaining cold treatment, Blt101 over-expressing transgenic wheat lines kept green in almost leaves while Bobwhite was blighted and withered in more than two leaves of five leaves. All transgenic lines and non-transgenic wheat undergone cold acclimation for seven days under the cold condition showed decreases of water-contents, but levels of the decrease were lower in transgenic wheat lines than non-transgenic wheat. This results were correlated to the osmoprotection observed in epidermal cells of onion expressed Blt101-GFP. All results indicated that Blt101 might have a function protecting water loss and play a role regulating development of barley in cold (or drought) condition.
보리에서 저온에 의해 빠르게 발현된 후 crown 부위에 집적되는 특징을 보이는 Blt101 (barley lipid transfer protein 101)의 기능을 분석하고자, 4일간 단일조건에서 저온순화한 동보리1호의 잎에서 얻은 cDNA를 이용하여 RT-PCR을 통해 blt101을 동정하였다.
Real time PCR을 통해 Blt101이 저온에 의해 보리의 잎, 생장점 그리고 뿌리에서 모두 발현됨이 확인하였으며, 2주 이상 저온순화 시에는 crown 부위 및 뿌리 부위에서 맥주보리와 겉보리 간의 Blt101의 발현차이가 확인되었다. 이 결과는 또한 western 분석에서도 적용되었다. 맥주보리와 겉보리에서 Blt101의 발현차이가 Blt101의 염기서열의 차이에서 비롯되었는지 확인하기 위하여 각 품종에서 클로닝한 blt101의 염기서열을 비교한 결과, 모든 품종에서 coding sequence는 차이가 없었으며, 단지 promoter 의 일부분 및 3’ UTR 부분의 염기서열에서 차이가 존재하였다. Blt101의 promoter 및 3’ UTR의 차이가 맥주보리와 겉보리에서의 Blt101의 발현차이의 원인으로 예상하였다.
Blt101의 발현위치를 확인하고자 수행한 promoter 분석은 Blt101이 보리의 crown 부위와 뿌리 끝부분, 그리고 새로 출현한 잎의 신장부분에서 발현함을 보였다. 이는 Blt101의 발현이 식물의 생육에 관여함을 알 수 있었다.
막단백질, 세포질단백질, 세포밖단백질을 각각 저온순화한 동보리1호에서 분리하여 실시한 western 분석과 양파세포를 이용한 Blt101의 일시적 발현 실험을 통해 Blt101이 식물세포막 주변에 집적하는 것으로 확인되었으며, 양파세포의 plasmolysis 실험을 통해 Blt101이 탈수 억제 기능을 가지고 있음이 확인되었다.
Blt101 과발현 형질전환체는 비형질전환체와 비교 시 상온에서 초기 생육 지연을 보였으며, 저온순화 시 그 생육지연은 더욱 두드러졌을 뿐 아니라 고엽이 없었다. 또한 저온 순화 시 비형질전환체에 비해 높은 수분함량을 보유하였다.
이 모든 실험 결과를 종합해 볼 때, Blt101은 월동 시 보리의 성장부위에 집적하여, 보리의 생육을 억제할 뿐만 아니라, 다양한 스트레스에 의한 탈수로부터 보리의 생장점을 보호함으로서 내동성 증진에 기여하는 기능이 있음이 사료되었다.
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